Как расшифровывается цтк? Значения аббревиатур и сокращений на сайте

Анаболические пути

Из α-кетоглутарата, образующегося в цикле трикарбоновых кислот, синтезируются аминокислоты глутамин, глутамат, пролин и аргинин. Сукцинил-КоА выступает в качестве предшественника при синтезе порфиринов и гема.

Цитрат участвует в синтезе жирных кислот[en] и стеролов (из цитрата образуется ацетил-КоА, кроме того, он выступает в роли регулятора[26]).

Малат может транспортироваться из митохондрий в цитоплазму, где он обратимо превращается в оксалоацетат. Получившийся оксалоацетат может служить предшественником для синтеза аминокислот аспартата, аспарагина, метионина, треонина и изолейцина, а также пиримидинов.

Он может также превратиться в фосфоенолпируват с затратой ГТФ, а фосфоенолпируват (ФЕП) может служить предшественником в биосинтезефенилаланина, тирозина, триптофана, серина, глицина и цистеина.

Пируват, получающийся из ФЕП в процессе гликолиза, может стать предшественником аланина, лейцина и валина, а также может участвовать в глюконеогенезе[24][25].

Анаплеротические пути

Промежуточные соединения цикла трикарбоновых кислот, покинувшие цикл и задействованные в синтезе различных соединений, замещаются за счёт специальных анаплеротических реакций[en].

В нормальных условиях реакции, в ходе которых промежуточные соединения цикла вовлекаются в другие метаболические пути, и реакции, возмещающие их уход, находятся в динамическом равновесии, поэтому концентрация промежуточных соединений цикла трикарбоновых кислот поддерживается постоянной[25].

Ниже в таблице представлены важнейшие анаплеротические реакции[25]:

В печени и почках млекопитающих наиболее важной анаплеротической реакцией является обратимое карбоксилирование пирувата с образованием оксалоацетата, катализируемое ферментом пируваткарбоксилазой. Когда в цитратном цикле уменьшается количество оксалоацетата или других промежуточных соединений, пируват карбоксилируется, образуя дополнительный оксалоацетат.

Ферментативное добавление карбоксильной группы к пирувату требует энергии, которая берётся из АТФ: свободная энергия, необходимая для присоединения карбоксильной группы к пирувату практически равна свободной энергии, которую можно получить из АТФ.

Пируваткарбоксилаза — регуляторный фермент, и она инактивируется в отсутствие ацетил-КоА — положительного аллостерического модулятора. Когда же ацетил-КоА — «топливо» для цикла трикарбоновых кислот — присутствует в избытке, он стимулирует пируваткарбоксилазную реакцию и тем самым способствует образованию оксалоацетата, что, в свою очередь, даёт возможность вовлекать в цикл трикарбоновых кислот больше ацетил-КоА.

Для осуществления пируваткарбоксилазной реакции необходим витаминбиотин, выступающий в качестве простетической группы фермента, переносящей СО2. Биотин должен присутствовать в рационе человека, он содержится во многих продуктах и синтезируется кишечными бактериями[27].

Другие анаплеротические реакции, указанные в таблице выше, также регулируются таким образом, чтобы обеспечивать концентрацию промежуточных соединений, достаточную для функционирования цикла трикарбоновых кислот. Например, фосфоенолпируваткарбоксилаза активируется фруктозо-1,6-бисфосфатом — промежуточным соединением гликолиза, которое накапливается в условиях избытка пировиноградной кислоты[27].

У растений и бактерий в ходе глиоксилатного цикла ацетил-КоА может превращаться в сукцинат. Таким образом, эти организмы могут осуществлять анаплеротическую деградацию нейтральных жиров (подробнее о глиоксилатном цикле см. ниже)[4].

Существуют и другие анаплеротические пути. Аминокислоты гистидин, пролин, аргинин, глутамин и глутамат могут превращаться в α-кетоглутарат и восстанавливать его концентрацию; изолейцин, валин, метионин, триптофан — в сукцинил-КоА, аспартат, фенилаланин и тирозин — в фумарат; аспартат и аспрагин — в оксалоацетат.

История изучения

Несколько соединений и реакций цикла трикарбоновых кислот были открыты в 1930 году Альбертом Сент-Дьёрди, в частности, он установил роль фумарата, ключевого компонента цикла. За свои открытия в 1937 году Сент-Дьёрди был удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине[34].

Полностью последовательность реакций и образующихся соединений в 1937 году установил Ханс Адольф Кребс, за что в 1953 году он получил Нобелевскую премию (совместно с Ф. Липманом)[35] (в его честь цикл трикарбоновых кислот получил одно из своих названий).

Когда около 60 лет назад стали доступны тяжёлый изотоп углерода 13C и радиоактивные изотопы11C и 14C, они были использованы для того, чтобы проследить путь атомов углерода в цикле трикарбоновых кислот. Один из таких экспериментов дал весьма неожиданные результаты.

Ацетат, меченный по гидроксильной группе, был соединён с немеченым оксалоацетатом с образованием меченого цитрата. Поскольку цитрат — симметричная молекула, то предполагалось, что он будет преобразован в α-кетоглутарат, среди которого будут молекулы, меченые по разным атомам углерода.

Тем не менее, из клеток был выделен лишь один «сорт» молекул α-кетоглутарата, и исследователи заключили, что цитрат и любая другая симметричная молекула не может быть промежуточным соединением на пути от ацетата к α-кетоглутарату; они предположили, что в результате конденсации ацетата и оксалоацетата образовывалась несимметричная трикарбоновая кислота, например, цис-аконитат или изоцитрат.

В 1948 году Александр Огстон установил прохиральность цитрата (склонность к асимметричным реакциям в отсутствие хирального центра), объяснив тем самым результаты экспериментов и подтвердив, что именно цитрат образуется в первой стадии цикла[36].

Клиническое значение

Когда механизмы регуляции таких путей, как цикл трикарбоновых кислот, нарушаются, то результатом может стать развитие серьёзного заболевания. Ферменты цикла кодируются генами домашнего хозяйства, и отсутствие функциональных копий этих генов может быть объяснено наличием тканеспецифичных особенностей проведения цикла[30].

Дефекты гена фумаразы приводят к появлению опухолейгладких мышц (лейомиомы) и почек; мутации сукцинатдегидрогеназы вызывают ракнадпочечников (феохромоцитому).

В культурах клеток с такими мутациями накапливаются фумарат (в случае мутаций фумаразы) и, в меньшей степени, сукцинат (в случае мутаций сукцинатдегидрогеназы), и это накопление активирует транскрипционный факторHIF-1α, индуцируемый гипоксией.

Развитие рака может быть следствием состояния псевдогипоксии. В клетках с такими мутациями наблюдается повышенная экспрессия генов, в норме регулируемых HIF-1α. Такие последствия мутаций генов фумаразы и сукцинатдегидрогеназы позволяют относить их к супрессорам опухолей[31].

Показана связь дефектов фумаразы и нарушений работы нервной системы[32].

Мутации, изменяющие активность α-кетоглутаратдегидрогеназы, приводят к накоплению в моче продуктов распада аминокислот, из-за чего моча приобретает запах кленового сиропа. Это заболевание называется лейциноз (англ. Maple syrup urine disease)[33].

Модификации и родственные пути

Как упоминалось выше, неполный цикл трикарбоновых кислот имеется у некоторых анаэробных организмов. У них он служит не для получения энергии, а для получения предшественников для биосинтетических процессов. Эти организмы используют первые три реакции цикла, чтобы получить α-кетоглутарат, однако, лишённые α-кетоглутаратдегидрогеназы, они не могут осуществлять все превращения цикла.

У них, однако, имеются 4 фермента, катализирующих последовательное превращение оксалоацетата в сукцинил-КоА, поэтому они могут образовывать малат, фумарат, сукцинат и сукцинил-КоА из оксалоацетата в ходе реакций, обратных «нормальным» (окислительным) реакциям цикла.

Этот путь представляет собой брожение, в ходе которого НАДН, образующийся при окислении изоцитрата, переводится в НАД восстановлением оксалоацетата до сукцината[23].

У растений, некоторых беспозвоночных и некоторых микроорганизмов (например, дрожжей, Escherichia coli) ацетил-КоА превращается в сукцинат в ходе глиоксилатного цикла, тесно связанного с циклом трикарбоновых кислот. Общее уравнение глиоксилатного цикла выглядит так:

2 ацетил-КоА НАД 2H₂O → сукцинат 2КоА НАДН H

Образующийся сукцинат далее участвует в биосинтетических процессах. У растений глиоксилатный цикл локализован в особых органеллах — глиоксисомах[28][4].

Некоторые бактерии способны осуществлять обратный цикл трикарбоновых кислот. В ходе этого процесса реакции цикла трикарбоновых кислот осуществляются в обратном направлении: там, где в цикл поступают атомы углерода в виде ацетил-КоА и впоследствии окисляются до СО2, в обратном цикле, наоборот, выделяется ацетил-КоА.

Для его осуществления необходимы доноры электронов, и для этих целей бактерии используют водород, сульфиды или тиосульфаты. К ферментам обратного цикла, отличным от соответствующих ферментов прямого цикла, относятся АТФ-цитратлиаза[en], 2-оксоглутарат: ферредоксиноксиредуктаза, пируватсинтаза[en].

Общий обзор

В начале цикла трикарбоновых кислотацетил-кофермент А (ацетил-КоА) отдаёт свою ацетильную группу четырёх углеродному соединению — оксалоацетату (щавелевоуксусной кислоте), при этом образуется шестиуглеродный цитрат (лимонная кислота).

Ацетил-КоА является продуктом окисления таких соединений, как глюкоза, аминокислоты и жирные кислоты[6]. Цитрат затем изомеризуется в изоцитрат (изолимонную кислоту), который далее дегидрируется и декарбоксилируется до пятиуглеродной кислоты — α-кетоглутарата.

α-Кетоглутарат вновь декарбоксилируется, превращаясь в четырёхуглеродный сукцинат (янтарная кислота). Сукцинат затем в три этапа ферментативно превращается в четырёхуглеродный оксалоацетат, который готов прореагировать с новой молекулой ацетил-КоА.

В каждый оборот цикла одна ацетильная группа (то есть два атома углерода) приходит в цикл в виде ацетил-КоА, и два же атома углерода покидают цикл в виде двух молекул CO2; одна молекула оксалоацетата используется для образования цитрата, и одна же впоследствии регенерируется.

Оксалоацетат не покидает цикл, и одна молекула оксалоацетата теоретически может связывать неограниченное количество ацетильных групп и, на самом деле, оксалоацетат присутствует в клетках в очень низких концентрациях. Четыре из восьми стадий цикла представляют собой окислительные процессы, выделяющаяся при этих процессах энергия окисления эффективно запасается в виде восстановленныхкоферментов НАДН и ФАДH2[5].

Хотя цикл трикарбоновых кислот занимает центральное место в энергетическом метаболизме, его роль не сводится к получению и запасанию энергии. Четырёх- и пятиуглеродные промежуточные соединения цикла служат предшественниками для синтеза многих соединений.

Для восполнения этих промежуточных соединений, покинувших цикл, в клетке существуют специальные анаплеротические реакции[en][5]

Как упоминалось выше, все реакции цикла трикарбоновых кислот происходят в митохондриях, и в митохондриях же располагается дыхательная цепь (на внутренней мембране). У большей части бактерий ферменты цикла трикарбоновых кислот находятся в цитозоле, а плазматическая мембрана выполняет функции, аналогичные функциям внутренней мембраны митохондрий[5].

Примечания

Реакции цикла трикарбоновых кислот

Мы подготовили пируват к вступлению в ЦТК, что дальше? Давайте сначала решим такой вопрос — зачем вообще нужен такой сложный цикл. Всё-таки в нём целых восемь реакций! А всё ради того, чтобы окислить два углерода. Как-то не слишком экономно, вам не кажется? Может стоит просто окислить эти два углерода в одну реакцию и дело с концом?

Так делать нельзя. Если бы мы окислили ацетил-коэнзим А, то смогли бы получить только одну молекулу CO2 и метан. Так уж выходит, что организм умеет убирать углерод только с помощью реакций декарбоксилирования. Для этого нужны не только карбоксильные группы, но ещё кое-какие условия.

Организм идёт на хитрость — он делает целых восемь реакций для того, чтобы создать эти самые карбоксильные группы. А затем провести реакции декарбоксилирования с образованием двух молекул углекислого газа. И первая реакция ЦТК основная для создания карбоксильных групп.

Первая реакция. Образование цитрата. 

Оксалоацетат реагирует с ацетил-коэнзимом А — образуется цитрат и коэнзим А, катализатор — цитратсинтаза. Ацетильная группа присоединяется к оксалоацетату. При этом присоединение идёт по первому атому углерода ацетильной группы. Так клетка прячет углерод, который мог превратиться в метан.

Для этой реакции нужно много энергии. Как хорошо, что эта энергия заключена в ацетил-коэнзиме А. Ещё помните про тиоэфирную связь, которая гидролизуется с высвобождением большого количества энергии? Ну и хорошо. 

Есть ещё один плюсик — клетка получила коэнзим А, который снова может реагировать с пируватом, либо использоваться для чего-то ещё.

Вторая реакция. Подготовка цитрата к декарбоксилированию.

Клетка не может декарбоксилировать цитрат. Сейчас будет немного объяснений с химической точки зрения. Попытаемся разобраться с тем, почему организму так важны карбоксильные и карбонильные группы. 

Декарбоксилирование — это отщепление карбоксильной группы, при этом образуется углекислый газ. При декарбоксилировании разрушается ковалентная связь между двумя атомами углерода. 

Ковалентная связь образуется за счёт того, что каждый атом углерода даёт по электрону на её образование. Часто, когда ковалентная связь разрушается, то оба электрона остаются у одного атома. Углерод, у которого остались электроны, называется карбанионом. Атом, у которого их отобрали, карбкатионом. У карбаниона отрицательный заряд, а у карбкатиона положительный.

Карбанионы очень нестабильны — у них высокая реакционная способность. Представьте, что мы разрушили связь, но у нас две разноимённые частички — одна с плюсом, а другая с минусом. Они могут сразу же прореагировать (разноимённые заряды притягиваются и всё такое) и снова образовать связь, а нам такое не нужно. Нужно стабилизировать карбанион. Тут появляется карбонильная группа.

В карбонильной группе есть кислород, у которого огромная электроотрицательность. Он может перетащить на себя электроны от карбаниона — при этом между двумя углеродами образуется двойная связь, а кислород становится отрицательным. Так молекула стабилизируется, а значит можно спокойно проводить декарбоксилирование — разноимённые заряды не прореагируют друг с другом.

Как видите карбоксильная и карбонильная группы лежат рядом в этом примере. И это не случайно, если они будут далеко, то кислород не сможет стабилизировать карбанион. Значит они должны быть рядом! Примерно по такому принципу работало декарбоксилирование пирувата.

Вернёмся к нашему цитрату — здесь вообще нет карбонильной группы. Пока что. Но её можно образовать из гидроксильной группы, так что мы не паримся. Если мы создадим карбонильную группу у третьего атома углерода сейчас, то у нас будет пятивалентный углерод, что невозможно.

Для этого и нужна вторая реакция, которую катализирует аконитаза. Она проводит реакцию изомеризации — переносит гидроксильную группу на другой атом углерода. Реакция идёт в два этапа: сначала проходит реакция дегидратации с формированием двойной связи, а потом гидролиз. В митохондрии образуется изоцитрат.

Так лучше, теперь мы можем перевести гидроксильную группу в карбонильную. При этом рядом есть карбоксильная группа — у третьего атома углерода. Она будет стабилизироваться карбонильной при реакции декарбоксилирования. 

Третья реакция. Декарбоксилирование изоцитрата.

Клетка проводит реакцию образования карбонильной группы и декарбоксилирования в один этап. С помощью фермента — изоцитратдегидрогеназы. Сначала образуется карбонильная группа — это окислительно-восстановительная реакция. При этом НАД принимает на себя два электрона и протон (гидрид-ион)

Продукт этой реакции — альфа-кетоглутарат. В нём всё ещё есть две карбоксильных группы, но отщепить можно только одну. Вам ничего не напоминает карбоксильная и карбонильная группа снизу молекулы? Очень похоже на пируват, не правда ли? Так и хочется провести окислительное декарбоксилирование, которое мы разбирали выше.

Четвёртая реакция. Декарбоксилирование альфа-кетоглутарата. 

Когда разбирали пируватдегидрогеназный комплекс, то я сказал, что по такому же принципу идёт одна из реакций ЦТК. Поздравляю, вы уже знаете эту реакцию!  Катализатор — альфа-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс, который состоит из трёх ферментов и пяти коферментов. Всё по аналогии с пируватдегидрогеназным. Поэтому не будем на этом останавливаться, просто напишем реакцию в один этап.

Здесь образуется ещё один НАДH и сукцинил-коэнзим А. 

Мы избавились от двух атомов углерода, которые вступили в цитратный цикл через ацетил-коэнзим А (вообще от других атомов, как видите красненькие всё еще остаются в молекуле). От обоих с помощью реакций декарбоксилирования. Теперь наша задача вернуться к тому, с чего все начиналось — оксалоацетату.

Пятая реакция. Образование сукцината. 

В сукцинил-коэнзиме А есть тиоэфирная связь. Напоминаю, что она макроэргическая. Значит её можно использовать для синтеза чего-нибудь. Клетка так и делает, потому что ей не хочется терять энергию просто так. Здесь будет, уже знакомая нам по гликолизу, реакция субстратного фосфорилирования.

Реакция идёт в два этапа. Сначала проходит фосфоролиз тиоэфирной связи с образованием сукцинил-фосфата. Фосфоролиз — это что-то вроде гидролиза, но вместо воды используется неорганический фосфат. Сукцинил-фосфат — это ангидрид из фосфорной и карбоновой кислот, прямо как в гликолизе.

У такого ангидрида есть макроэргическая связь. Дальше эта макроэргическая связь гидролизуется, что приводит к образованию энергии. При этом энергия гидролиза идёт на присоединение фосфорной группы к ГДФ. Фермент — сукцинил-коэнзим А-синтетаза. Продукты реакции — сукцинат, коэнзим А и ГТФ.

ГТФ потом можно превратить в АТФ, так что какой-то вклад в образование энергии у ЦТК есть. Получается, что в начале статьи я вас обманул. Но это был такой трюк, чтобы вы заинтересовались! 

Коэнзим А можно снова отправить на пируватдегидрогеназный или альфа-кетоглутаратдегидрогеназный комплексы. 

Шестая реакция. Образование фумарата. 

Мы закончили с декарбоксилированием, но ещё можно вытащить из молекул немного электронов на пути к образованию оксалоацетата. 

Что будем делать с сукцинатом для образования оксалоацетата? Для начала нужно присоединить к нему молекулу воды — провести гидроксилирование, но для этого нужна двойная связь. Ну и чего сидим? Давайте делать. Сукцинат-дегидрогеназа отщепляет от сукцината два атома водорода. Для этого нужен кофермент — ФАД. В этой реакции образуется фумарат и ФАДH2.

Сукцинат-дегидрогеназа необычный фермент, даже не из-за того, что использует кофермент ФАД, а все остальные использовали НАД . Особенность в том, что этот фермент — часть цепи переноса электронов. А если точнее, то второго комплекса цепи переноса электронов.

Седьмая реакция. Образование малата. 

Теперь проводим гидролиз фумарата. Фермент — фумараза. Вода присоединяется по двойной связи с образованием малата. 

У этого фермента есть стереоспецифичность. Строение активного центра таково, что в этой реакции образуется L-малат. Потому что только из него можно образовать оксалоацетат. 

Остался последний шаг — провести дегидрирование малата. 

Восьмая реакция. Образование оксалоацетата. 

В этой реакции получится урвать ещё парочку электронов. Фермент — малатдегидрогеназа, кофермент — НАД . 

Дегидрирование малата приводит к образованию оксалоацетата и НАДH. Мы вернулись к оксалоацетату, поздравляю! 

Забыл сказать, все реакции после декарбоксилирования, начиная с пятой, обратимые. Первые, третья и четвёртая реакция — необратимы.

Мы с тобой договорились, что суть ЦТК для катаболизма — перенос электронов на коферменты НАД и ФАД. Давай суммируем, что он сделал из одной молекулы ацетил-коэнзима А. В ходе третьей, четвертой и восьмой реакции получены по одному НАДH.

В ходе шестой реакции — один ФАДH2. Получается, что цитратный цикл вытащил из одной молекулы ацетил-коэнзима А целых восемь электронов! Да, он сделал это не совсем честно. Без оксалоацетата такое количество не получить. Но победителей не судят.

По секрету скажу, что из этих восьми электронов будет синтезировано девять молекул АТФ. Но эта тема останется для цепи переноса электронов.

И ещё из интересного. В ходе цикла декарбоксилированы были не атомы углерода из ацетил-коэнзима А, а из оксалоацетата. Проследите за ними на цикле, я отметил их красным цветом. Один атом углерода из ацетил-коэнзима А будет декарбоксилирован в ходе второго цикла, а второй атом в ходе третьего.

Напомню, что ещё одна молекула НАДH была получена в ходе окислительного декарбоксилирования пирувата.

Из одной глюкозы образуется два пирувата, поэтому коферменты и ГТФ нужно удвоить.

Регуляция

Регуляция ферментов метаболического пути может осуществляться при помощи аллостерических эффекторов и ковалентных модификаций, поддерживая концентрацию промежуточных и конечных продуктов в клетке постоянной и препятствуя их чрезмерному образованию.

Переход углеродных атомов от пирувата к циклу трикарбоновых кислот тонко регулируется на двух уровнях: превращение пирувата в ацетил-КоА, стартовое соединение для цикла (пируватдегидрогеназная реакция), и вход активного ацетата в цикл (цитратсинтазная реакция).

Ацетил-КоА образуется не только пируватдегидрогеназным комплексом (PDH), но также при окислении жирных кислот (β-окисление) и некоторых аминокислот, поэтому для регуляции окисления пирувата и цикла трикарбоновых кислот также важен контроль этих путей.

Кроме того, цикл регулируется на изоцитратдегидрогеназной и α-кетоглутаратдегидрогеназной реакциях. Ниже будет рассмотрена регуляция собственно цикла трикарбоновых кислот[20]; о регуляции окислительного декарбоксилирования пирувата см. статью Окислительное декарбоксилирование пирувата.

Итак, поступление метаболитов в цикл трикарбоновых кислот строго регулируется. Поступления метаболитов определяется тремя факторами: доступностью субстрата, подавлением накапливающимися продуктами и аллостерическим подавлением по типу обратной связи ферментов, катализирующих начальные этапы цикла[21].

Каждая из трёх экзергонических стадий цикла — стадии, катализируемые цитратсинтазой, изоцитратдегидрогеназой и α-кетоглутаратдегидрогеназой — при некоторых условиях могут стать скоростьлимитирующими[en].

Доступность субстратов для цитратсинтазы (ацетил-КоА и оксалоацетата) варьирует в зависимости от состояния клетки и иногда сдерживает скорость образования цитрата. НАДН, продукт окисления изоцитрата и α-кетоглутарата, при некоторых условиях накапливается, и при большом значении отношения [НАДН]/[NAD ] обе дегидрогеназные реакции строго подавляются.

Аналогично, в клетке малатдегидрогеназная реакция находится в строгом равновесии (то есть она лимитируется субстратом), и при большом значении отношения [НАДН]/[NAD ] и низкой концентрации оксалоацетата первая стадия цикла замедляется. Накопление продуктов ограничивает все три лимитирующие стадии цикла:

сукцинил-КоА подавляет α-кетоглутаратдегидрогеназу (а также цитратсинтазу); цитрат блокирует цитратсинтазу; конечный продукт, АТФ, подавляет цитратсинтазу и изоцитратдегидрогеназу. АДФ — аллостерический активатор цитратсинтазы — уменьшает ингибирующее влияние на этот фермент АТФ.

В мышечной тканипозвоночных ионы Са2 , служащие сигналом к сокращению и сопутствующие увеличению потребности в АТФ, активируют изоцитратдегидрогеназу и α-кетоглутаратдегидрогеназу, а также пируватдегидрогеназный комплекс (PDH).

Таким образом, концентрация субстратов и промежуточных соединений в цикле трикарбоновых кислот задаёт такой поток углерода через него, при котором концентрации образующихся АТФ и НАДН будут оптимальны[22].

В норме скорости гликолиза и цикла трикарбоновых кислот тесно связаны, так что в пируват превращается лишь такое количество глюкозы, которое обеспечит цикл достаточным количеством «топлива» — ацетильными группами ацетил-КоА. Концентрации пирувата, лактата и ацетил-КоА в норме поддерживаются постоянными.

Скорость гликолиза связана со скоростью цикла трикарбоновых кислот не только через ингибирование гликолиза высокими уровнями АТФ и НАДН, которое характерно и для гликолиза, и для дыхательного этапа окисления глюкозы, но также и концентрацией цитрата.

Стадия 1: образование цитрат-иона

Первой реакцией цикла является необратимаяконденсацияацетил-КоА с оксалоацетатом с образованием цитрата, катализируемая ферментом цитратсинтазой (реакция 1 на общей схеме):

В этой реакции метильная группа в составе ацетильной группы ацетил-КоА присоединяется к карбонильной группе (второму атому углерода, C2-атом) оксалоацетата. В ходе этой реакции в активном центре фермента образуется промежуточное соединение — цитроил-КоА.

Оно быстро подвергается гидролизу и расщепляется на свободный КоА и цитрат, которые удаляются из активного центра фермента. Гидролиз этого высокоэнергетичного тиоэфирного промежуточного соединения делает эту реакцию весьма экзергонической.

Большое отрицательное изменение стандартной свободной энергии цитратсинтазной реакции необходимо для управления циклом, поскольку, как отмечалось ранее, в норме концентрация оксалоацетата в клетке очень мала. КоА, высвобождаемый при этой реакции, далее участвует в окислительном декарбоксилировании следующей молекулы пирувата при помощи пируватдегидрогеназного комплекса[7].

Цитратсинтаза была закристаллизована, и был проведён её рентгеноструктурный анализ в присутствии и отсутствии её субстрата и ингибиторов. Каждая субъединица этого гомодимерного фермента представляет собой единый полипептид с двумя доменами, один из которых — крупный и жёсткий, а другой — менее крупный и более пластичный; между этими доменами располагается активный центр фермента.

Оксалоацетат — первый из субстратов, связывающихся с цитратсинтазой, — индуцирует значительные конформационные изменения в пластичном домене, создавая сайт связывания для молекулы второго субстрата — ацетил-КоА (см. справа).

Когда в активном центре фермента образуется цитроил-КоА, в ферменте происходит второе конформационное изменение, обусловленное гидролизом тиоэфира с высвобождением КоА. Эти изменения конформации, вызванные сначала связыванием с субстратом, потом — промежуточным продуктом, препятствуют преждевременному и непродуктивному разрыву тиоэфирной связи в ацетил-КоА.

Кинетические исследования цитратсинтазы подтверждают описанный выше двусубстратный механизм её работы. Вышеописанная цитратсинтазная реакция представляет собой альдольную конденсацию[8][9] (впрочем, некоторые авторы рассматривают её как конденсацию Клайзена[7]). Ниже представлен механизм цитратсинтазной реакции:

1. Тиоэфирная связь в ацетил-КоА активирует атомы водорода в метильной группе. Остатокаспартата в активном центре цитратсинтазы отщепляет протон от метильной группы, образуя промежуточное енольное соединение. Это соединение стабилизируется водородной связью и/или протонированием^[en] остатком гистидина His²⁷⁴ в активном центре фермента.
2. Промежуточное енольное соединение атакует карбонильный атом углерода оксалоацетата, при этом водородная связь с His²⁷⁴ сохраняется. В роли кислоты при атаке оксалоацетата выступает другой остаток гистидина, His³²⁰, отдающий оксалоацетату свой протон. В результате конденсации образуется промежуточное соединение цитроил-КоА.
3. Тиоэфирная связь в цитроил-КоА гидролизуется с высвобождением КоА и образованием цитрата^[10].

Стадия 2: образование изоцитрата через цис-аконитат

Фермент аконитаза (точнее, аконитатгидратаза) катализирует обратимую изомеризацию цитрата в изоцитрат через образование промежуточного соединения — трикарбоновой кислоты цис-аконитата, которая при этом в норме не покидает активный центр.

Аконитаза присоединяет воду по двойной связи связанного с её активным центром цис-аконитата двумя разными способами: в результате одного из них образуется цитрат, в результате другого — изоцитрат (реакции 2 и 3 на общей схеме)[7]:

Хотя в равновесной смеси при pH 7,4 и температуре 25 °С содержится менее 10 % изоцитрата, в клетке реакция смещена вправо, поскольку изоцитрат быстро вовлекается в следующую стадию цикла, и его концентрация уменьшается.

Аконитаза содержит железосерный кластер, который служит как для связывания субстрата в активном центре, так и для каталитической гидратации или дегидратации. В клетках, не содержащих достаточного количества железа, аконитаза утрачивает свой железосерный кластер и приобретает регуляторную роль в метаболизме железа[en] (подробнее см.

Ниже представлена схема, иллюстрирующая, как железосерный кластер аконитазы связывает изоцитрат и преобразует его в цис-аконитат:

Стадия 3: окисление изоцитрата до α-кетоглутарата

В следующей стадии фермент изоцитратдегидрогеназа[en] катализирует окислительное декарбоксилирование[en] изоцитрата с образованием α-кетоглутарата (оксоглутарата).

Ион Mn2 (или Mg2 )[11] в активном центре фермента взаимодействует с карбонильной группой промежуточного соединения оксалосукцината[en], который образуется быстро, однако не покидает активного центра до тех пор, пока не декарбоксилируется и не превратится в α-кетоглутарат[10].

Ниже подробно рассмотрены эти превращения (реакции 4 и 5 на общей схеме):

1. Изоцитрат окисляется при переносе водорода от изоцитрата на НАД или НАДФ , в зависимости от изозима изоцитратдегидрогеназы (об изозимах см. ниже). В результате окисления образуется оксалосукцинат.
2. Декарбоксилирование оксалосукцината облегчается оттягиванием электронной плотности ионом Mn² (или Mg² ). В результате образуется промежуточное енольное соединение.
3. Енольное соединение перестраивается, превращаясь в α-кетоглутарат^[12].

В клетках обнаружены две различных формы (изозима) изоцитратдегидрогеназы. Для функционирования одной из них нужен НАД , для другой — НАДФ (причём для активности последней нужен ион Mg2 , а не Mn2 [11]).

Осуществляемые ими реакции в остальном идентичны. У эукариот НАД-зависимый изозим локализован в митохондриальном матриксе и участвует в цикле трикарбоновых кислот. Главной функцией НАДP-зависимого изозима, встречающегося как в митохондриальном матриксе, так и в цитозоле, возможно, является образование НАДФH, который необходим для восстановительных анаболических процессов[13].

Стадия 4: окисление α-кетоглутарата до сукцинил-коа

В следующей стадии цикла трикарбоновых кислот также происходит окислительное декарбоксилирование, при котором α-кетоглутарат превращается в сукцинил-КоА и СО2 под действием α-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса[en]; в качестве акцептора электронов выступает НАД , а КоА функционирует как переносчик сукцинильной группы.

Эта реакция практически идентична пируватдегидрогеназной реакции окислительного декарбоксилирования пирувата, а α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс чрезвычайно близок к пируватдегидрогеназному комплексу (ПДК) по структуре и функциям. Он включает 3 фермента, гомологичных ферментам E1, E2 и E3 ПДК, и его кофакторами также являются тиаминпирофосфат, липоат, ФАД, НАД и кофермент А.

Несомненно, оба комплекса имеют общего эволюционного предка. Хотя ферменты E1 обоих комплексов структурно схожи, их аминокислотные последовательности различаются и, конечно, они специфичны к разным субстратам: E1 комплекса ПДК связывает пируват, а E1 α-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса связывает α-кетоглутарат.

Ферменты E2 обоих комплексов также очень похожи, и оба ковалентно связываются с липоатом. Субъединицы E3 обоих комплексов идентичны[14].

Стадия 5: превращение сукцинил-коа в сукцинат

Сукцинил-КоА, как и ацетил-КоА, содержит тиоэфирную связь с большой отрицательной стандартной свободной энергией гидролиза (ΔG′о ≈ −36 кДж/моль). В следующей стадии цикла трикарбоновых кислот энергия, выделяемая при расщеплении тиоэфирной связи, используется на образование фосфоангидридной связи[en] в ГТФ или АТФ, при этом сукцинил-КоА превращается в сукцинат[14] (реакция 6 на общей схеме):

Эта обратимая реакция катализируется ферментом сукцинил-КоА-синтетазой[en] (сукцинилтиокиназой); из обоих названий этого фермента следует, что в этой реакции участвует нуклеозидтрифосфат[14].

Эта энергозапасающая реакция включает промежуточные этапы, на которых молекула фермента сама становится фосфорилированной по остатку гистидина в активном центре. Эта фосфорильная группа, которая имеет высокий потенциал для переноса, переносится на АДФ или ГДФ с образованием АТФ или ГТФ соответственно.

В клетках животных имеется два изозима сукцинил-КоА-синтетазы, один из которых специфичен к АДФ, а другой — к ГДФ. Сукцинил-КоА-синтетаза состоит из двух субъединиц: α-субъединица (Mr = 32 000) содержит фосфорилируемый остаток гистидина (His246) и место связывания КоА, а β-субъединица (Mr = 42 000) обеспечивает специфичность связывания с AДФ или ГДФ.

Активный центр находится в промежутке между субъединицами. Кристаллическая структура сукцинил-КоА-синтетазы содержит две «силовые спирали» (англ. power helices), по одной в каждой субъединице, причём эти спирали ориентированы таким образом, что их электрические дипольные моменты смещают частично положительные заряды к отрицательно заряженному гистидинфосфату (P—His); благодаря этому стабилизируется промежуточная фосфорилированная форма фермента[15]. Ниже представлена схема реакции, катализируемой сукцинил-КоА-синтетазой:

Образование ATФ (или ГТФ) за счёт энергии, запасённой при окислительном декарбоксилировании α-кетоглутарата, является реакцией субстратного фосфорилирования, как и синтез ATФ при гликолизе, катализируемый глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой[en] и пируваткиназой.

ГТФ, синтезированный сукцинил-КоА-синтетазой, может отдать свою терминальную фосфорильную группу АДФ с образованием АТФ в ходе обратимой реакции, катализируемой нуклеозиддифосфаткиназой[en]:

ГТФ АДФ → ГДФ АТФ, ΔG′^о = 0 кДж/моль.

Таким образом, конечным результатом активности любого изозима сукцинил-КоА-синтетазы является запасание энергии в виде АТФ. Изменение энергии Гиббса в нуклеозидифосфаткиназной реакции равно нулю, и АТФ и ГТФ энергетически эквивалентны друг другу[16].

Стадия 6: окисление сукцината до фумарата

Сукцинат, образовавшийся из сукцинил-КоА, окисляется в фумарат под действием флавопротеинасукцинатдегидрогеназы[17] (реакция 8 на общей схеме):

У эукариот сукцинатдегидрогеназа прочно связана со внутренней митохондриальной мембраной, у бактерий она располагается на плазматической мембране. Этот фермент содержит 3 различных железосерных кластера и одну молекулу ковалентно связанного с ним ФАД, являющегося простетической группой фермента.

Электроны от сукцината проходят через ФАД и железосерные кластеры, а далее они в составе переносчиков электронов попадают на дыхательную электронтранспортную цепь, расположенную на внутренней мембране митохондрий (плазматической мембране у бактерий).

ФАД при этом восстанавливается до ФАДH2, однако дальнейшим акцептором электронов является убихинон[2]. Переход электронов от сукцината через эти переносчики на конечный акцептор электронов — кислород — сопряжён с синтезом АТФ, причём на пару электронов образуется 1,5 молекулы АТФ.

Малонат, обычно отсутствующий в клетках, является сильным конкурентным ингибитором сукцинатдегидрогеназы, и добавление этого соединения в митохондрии блокирует активность цикла трикарбоновых кислот[17].

Энергетика

Выше были рассмотрены реакции, составляющие один оборот цикла трикарбоновых кислот. Двухуглеродная ацетильная группа входит в цикл, соединяясь с оксалоацетатом. Два атома углерода покидают цикл в виде двух молекул СО2, образовавшихся при окислении изоцитрата и α-кетоглутарата.

Энергия, выделившаяся при этих реакциях окисления, запасается в виде восстановленных трёх молекул НАДН, одной молекулы ФАДH2 и одной молекулы АТФ или ГТФ. В конце цикла молекула оксалоацетата регенерируется. Стоит отметить, что те два углеродных атома, которые покидают цикл в виде двух молекул СО2, отличны от тех двух углеродных атомов, которые поступили в цикл (на этом обороте) в виде ацетильной группы.

Хотя в ходе цикла трикарбоновых кислот непосредственно образуется лишь одна молекула АТФ на оборот (при превращении сукцинил-КоА в сукцинат), четыре окислительные реакции цикла обеспечивают дыхательную цепь значительным числом электронов, поставляемых НАДН и ФАДH2, и тем самым обеспечивают образование значительного количества АТФ в ходе окислительного фосфорилирования[3].

В ходе гликолиза из одной молекулы глюкозы образуется две молекулы пирувата, 2 АТФ и 2 НАДН. В ходе окислительного фосфорилирования переход двух электронов с НАДН на O2 обеспечивает образование 2,5 АТФ, а переход двух электронов с ФАДH2 на O2 даёт 1,5 АТФ.

Когда обе молекулы пирувата окисляются до 6 СО2 пируватдегидрогеназным комплексом и в ходе цикла трикарбоновых кислот, а электроны переносятся на O2 в ходе окислительного фосфорилирования, то суммарный выход АТФ составляет 32 молекулы на молекулу глюкозы[3]:

32 молекулы АТФ эквивалентны 32 × 30,5 кДж/моль = 976 кДж/моль, что составляет 34 % от теоретического максимума при полном окислении глюкозы — 2 840 кДж/моль. Эти вычисления произведены с учётом стандартных значений изменений свободной энергии, однако, если учитывать реальную нужду клетки в свободной энергии, заключённой в АТФ, то эффективность процесса окисления приближается к 65 % от теоретического максимума[19].