приложение в (справочное). определение наиболее вероятного числа (нвч) | гарант
Приложение В
(справочное)
Определение наиболее вероятного числа (НВЧ)
Таблица В.1
Значения НВЧ на пробу для анализа и пределы 95%-ного доверительного интервала для серии из 10 пробирок, рассчитанные в соответствии со ссылкой [29]
Число положительных пробирок | Серия из 10 пробирок | |||
НВЧ | Стандартная неопределенность НВЧ | 95%-ный доверительный интервал | ||
Нижний предел | Верхний предел | |||
1 | 0,11 | 0,435 | 0,02 | 0,75 |
2 | 0,22 | 0,308 | 0,06 | 0,89 |
3 | 0,36 | 0,252 | 0,11 | 1,11 |
4 | 0,51 | 0,220 | 0,19 | 1,38 |
5 | 0,69 | 0,198 | 0,28 | 1,69 |
6 | 0,92 | 0,184 | 0,40 | 2,10 |
7 | 1,20 | 0,174 | 0,55 | 2,64 |
8 | 1,61 | 0,171 | 0,75 | 3,48 |
9 | 2,30 | 0,179 | 1,03 | 5,16 |
Таблица В.2
Значения НВЧ на пробу для анализа и пределы 95%-ного доверительного интервала для серии из 15 пробирок, рассчитанные в соответствии со ссылкой [29]
Число положительных пробирок | Серия из 15 пробирок | |||
НВЧ | Стандартная неопределенность НВЧ | 95%-ный доверительный интервал | ||
Нижний предел | Верхний предел | |||
1 | 0,07 | 0,434 | 0,01 | 0,49 |
2 | 0,14 | 0,307 | 0,04 | 0,57 |
3 | 0,22 | 0,251 | 0,07 | 0,69 |
4 | 0,31 | 0,218 | 0,12 | 0,83 |
5 | 0,41 | 0,196 | 0,17 | 0,98 |
6 | 0,51 | 0,179 | 0,23 | 1,15 |
7 | 0,63 | 0,167 | 0,30 | 1,33 |
8 | 0,76 | 0,157 | 0,37 | 1,55 |
9 | 0,92 | 0,150 | 0,47 | 1,80 |
10 | 1,10 | 0,144 | 0,57 | 2,11 |
11 | 1,32 | 0,141 | 0,70 | 2,49 |
12 | 1,61 | 0,139 | 0,86 | 3,02 |
13 | 2,01 | 0,142 | 1,06 | 3,82 |
14 | 2,71 | 0,155 | 1,35 | 5,45 |
Таблица В.3
Значения НВЧ на пробу для анализа и пределы 95%-ного доверительного интервала для серии из 20 пробирок, рассчитанные в соответствии со ссылкой [29]
Число положительных пробирок | Серия из 20 пробирок | |||
НВЧ | Стандартная неопределенность НВЧ | 95%-ный доверительный интервал | ||
Нижний предел | Верхний предел | |||
1 | 0,05 | 0,434 | 0,01 | 0,36 |
2 | 0,11 | 0,307 | 0,03 | 0,42 |
3 | 0,16 | 0,251 | 0,05 | 0,50 |
4 | 0,22 | 0,218 | 0,08 | 0,60 |
5 | 0,29 | 0,195 | 0,12 | 0,69 |
6 | 0,36 | 0,178 | 0,16 | 0,80 |
7 | 0,43 | 0,165 | 0,20 | 0,91 |
8 | 0,51 | 0,155 | 0,25 | 1,03 |
9 | 0,59 | 0,147 | 0,31 | 1,16 |
10 | 0,69 | 0,140 | 0,37 | 1,30 |
11 | 0,80 | 0,134 | 0,44 | 1,46 |
12 | 0,92 | 0,130 | 0,51 | 1,65 |
13 | 1,05 | 0,126 | 0,59 | 1,85 |
14 | 1,20 | 0,123 | 0,69 | 2,10 |
15 | 1,39 | 0,121 | 0,80 | 2,40 |
16 | 1,61 | 0,121 | 0,93 | 2,77 |
17 | 1,90 | 0,122 | 1,09 | 3,29 |
18 | 2,30 | 0,127 | 1,30 | 4,08 |
19 | 3,00 | 0,141 | 1,58 | 5,67 |
Таблица В.4
Значения НВЧ на пробу для анализа и пределы 95%-ного доверительного интервала для серии из 25 пробирок, рассчитанные в соответствии со ссылкой [29]
Число положительных пробирок | Серия из 25 пробирок | |||
НВЧ | Стандартная неопределенность НВЧ | 95%-ный доверительный интервал | ||
Нижний предел | Верхний предел | |||
1 | 0,04 | 0,434 | 0,01 | 0,29 |
2 | 0,08 | 0,307 | 0,02 | 0,33 |
3 | 0,13 | 0,251 | 0,04 | 0,40 |
4 | 0,17 | 0,217 | 0,07 | 0,47 |
5 | 0,22 | 0,195 | 0,09 | 0,54 |
6 | 0,27 | 0,178 | 0,12 | 0,61 |
7 | 0,33 | 0,165 | 0,16 | 0,69 |
8 | 0,39 | 0,154 | 0,19 | 0,77 |
9 | 0,45 | 0,146 | 0,23 | 0,86 |
10 | 0,51 | 0,139 | 0,27 | 0,96 |
11 | 0,58 | 0,133 | 0,32 | 1,06 |
12 | 0,65 | 0,128 | 0,37 | 1,16 |
13 | 0,73 | 0,123 | 0,42 | 1,28 |
14 | 0,82 | 0,119 | 0,48 | 1,41 |
15 | 0,92 | 0,116 | 0,54 | 1,55 |
16 | 1,02 | 0,113 | 0,61 | 1,70 |
17 | 1,14 | 0,111 | 0,69 | 1,88 |
18 | 1,27 | 0,109 | 0,78 | 2,09 |
19 | 1,43 | 0,108 | 0,88 | 2,33 |
20 | 1,61 | 0,108 | 0,99 | 2,62 |
21 | 1,83 | 0,109 | 1,12 | 2,99 |
22 | 2,12 | 0,111 | 1,29 | 3,50 |
23 | 2,53 | 0,117 | 1,49 | 4,28 |
24 | 3,22 | 0,123 | 1,77 | 5,85 |
Таблица В.5
Индексы НВЧ и доверительные пределы (при уровне вероятности 95%) при использовании трех навесок 1 г , трех навесок 0,1 г и трех навесок 0,01 г
Число положительных результатов | Индекс | Доверительный интервал при уровне вероятности | ||||
Нижний предел | Верхний предел | |||||
0 | 0 | 0 | <0,30 | 0,00 | 0,94 | |
0 | 0 | 1 | 0,30 | 3 | 0,01 | 0,95 |
0 | 1 | 0 | 0,30 | 2 | 0,01 | 1 |
0 | 1 | 1 | 0,61 | 0 | 0,12 | 1,7 |
0 | 2 | 0 | 0,62 | 3 | 0,12 | 1,7 |
0 | 3 | 0 | 0,94 | 0 | 0,35 | 3,5 |
1 | 0 | 0 | 0,36 | 1 | 0,02 | 1,7 |
1 | 0 | 1 | 0,72 | 2 | 0,12 | 1,7 |
1 | 0 | 2 | 1,1 | 0 | 0,4 | 3,5 |
1 | 1 | 0 | 0,74 | 1 | 0,13 | 2 |
1 | 1 | 1 | 1,1 | 3 | 0,4 | 3,5 |
1 | 2 | 0 | 1,1 | 2 | 0,4 | 3,5 |
1 | 2 | 1 | 1,5 | 3 | 0,5 | 3,8 |
1 | 3 | 0 | 1,6 | 3 | 0,5 | 3,8 |
2 | 0 | 0 | 0,92 | 1 | 0,15 | 3,5 |
2 | 0 | 1 | 1,4 | 2 | 0,4 | 3,5 |
2 | 0 | 2 | 2,0 | 0 | 0,5 | 3,8 |
2 | 1 | 0 | 1.5 | 1 | 0,4 | 3,8 |
2 | 1 | 1 | 2,0 | 2 | 0,5 | 3,8 |
2 | 1 | 2 | 2,7 | 0 | 0,9 | 9,4 |
2 | 2 | 0 | 2,1 | 1 | 0,5 | 4 |
2 | 2 | 1 | 2,8 | 3 | 0,9 | 9,4 |
2 | 2 | 2 | 3,5 | 0 | 0,9 | 9,4 |
2 | 3 | 0 | 2,9 | 3 | 0,9 | 9,4 |
2 | 3 | 1 | 3,6 | 0 | 0,9 | 9,4 |
3 | 0 | 0 | 2,3 | 1 | 0,5 | 9,4 |
3 | 0 | 1 | 3,8 | 1 | 0,9 | 10,4 |
3 | 0 | 2 | 6,4 | 3 | 1,6 | 18,1 |
3 | 1 | 0 | 4,3 | 1 | 0,9 | 18,1 |
3 | 1 | 1 | 7,5 | 1 | 1,7 | 19,9 |
3 | 1 | 2 | 12 | 3 | 3 | 36 |
3 | 1 | 3 | 16 | 0 | 3 | 38 |
3 | 2 | 0 | 9,3 | 1 | 1,8 | 36 |
3 | 2 | 1 | 15 | 1 | 3 | 38 |
3 | 2 | 2 | 21 | 2 | 3 | 40 |
3 | 2 | 3 | 29 | 3 | 9 | 99 |
3 | 3 | 0 | 24 | 1 | 4 | 99 |
3 | 3 | 1 | 46 | 1 | 9 | 198 |
3 | 3 | 2 | 110 | 1 | 20 | 400 |
3 | 3 | 3 | > 110 | |||
(a) Источник: ссылка [27]. (b) См. таблицу В.6. (c) Доверительные пределы, приведенные в данной таблице, предназначены только для того, чтобы дать некоторые представления о влиянии на результаты статистических отклонений. Обычно имеют место и другие источники изменчивости, которые иногда могут быть значительными. | ||||||
Таблица В.6
Пояснение классификации результатов
Категория (a) | Определение |
1 | Найденное наиболее вероятное число (НВЧ) соответствует количеству бактерий в пробе с наибольшей вероятностью. Шанс получения результата менее вероятного, чем наименее вероятный из результатов данной категории, составляет 5% |
2 | Найденное наиболее вероятное число (НВЧ) соответствует количеству бактерий в пробе с меньшей вероятностью, чем даже в случае наименее вероятного из результатов категории 1, однако шанс получения результата менее вероятного, чем наименее вероятный из результатов данной категории, составляет не более 1% |
3 | Найденное наиболее вероятное число (НВЧ) соответствует количеству бактерий в пробе с меньшей вероятностью, чем даже в случае наименее вероятного из результатов категории 2, однако шанс получения результата менее вероятного, чем наименее вероятный из результатов данной категории, составляет не более 0,1% |
0 | Найденное наиболее вероятное число (НВЧ) соответствует количеству бактерий в пробе с меньшей вероятностью, чем даже в случае наименее вероятного из результатов категории 3. В данной категории шанс получения безошибочного результата составляет не более 0,1% |
(a) До начала испытания необходимо принять решение о приемлемости той или иной категории, например 1; 1 и 2 или даже 1, 2 и 3. Если на основе результатов принимается достаточно важное решение, следует признавать только результаты категории 1 или самое большее — категории 1 и 2. Результаты категории 0 следует принимать с большой осторожностью. | |
Таблица В.7
Значения НВЧ на грамм пробы и доверительные пределы при уровне вероятности 95% (если используют пять навесок по 1 г, пять по 0,1 г и пять по 0,01 г)
Число пробирок, давших положительную реакцию | НВЧ (на г) | Доверительные пределы при уровне вероятности 95% | |||
5 по 1 г | 5 по 0,1 г | 5 по 0,01 г | Нижний | Верхний | |
0 | 0 | 0 | <0,2 | <0,1 | 0,7 |
0 | 1 | 0 | 0,2 | <0,1 | 0,7 |
0 | 2 | 0 | 0,4 | <0,1 | 1,1 |
1 | 0 | 0 | 0,2 | <0,1 | 0,7 |
1 | 0 | 1 | 0,4 | <0,1 | 1,1 |
1 | 1 | 0 | 0,4 | < 0.1 | 1,1 |
1 | 1 | 1 | 0,6 | <0,1 | 1,5 |
2 | 0 | 0 | 0,5 | <0,1 | 1,3 |
2 | 0 | 1 | 0,7 | 0,1 | 1,7 |
2 | 1 | 0 | 0,7 | 0,1 | 1,7 |
2 | 1 | 1 | 0,9 | 0,2 | 2,1 |
2 | 2 | 0 | 0,9 | 0,2 | 2,1 |
2 | 3 | 0 | 1,2 | 0,3 | 2,8 |
3 | 0 | 0 | 0,8 | 0,1 | 1,9 |
3 | 0 | 1 | 1,1 | 0,2 | 2,5 |
3 | 1 | 0 | 1,1 | 0,2 | 2,5 |
3 | 1 | 1 | 1,4 | 0,4 | 3,4 |
3 | 2 | 0 | 1,4 | 0,4 | 3,4 |
3 | 2 | 1 | 1,7 | 0,5 | 4,6 |
3 | 3 | 0 | 1,7 | 0,5 | 4,6 |
4 | 0 | 0 | 1,3 | 0,3 | 3,1 |
4 | 0 | 1 | 1,7 | 0,5 | 4,6 |
4 | 1 | 0 | 1,7 | 0,5 | 4,6 |
4 | 1 | 1 | 2,1 | 0,7 | 6,3 |
4 | 1 | 2 | 2,6 | 0,9 | 7,8 |
4 | 2 | 0 | 2,2 | 0,7 | 6,7 |
4 | 2 | 1 | 2,6 | 0,9 | 7,8 |
4 | 3 | 0 | 2,7 | 0,9 | 8 |
4 | 3 | 1 | 3,3 | 1,1 | 9,3 |
4 | 4 | 0 | 3,4 | 1,2 | 9,3 |
5 | 0 | 0 | 2,3 | 0,7 | 7 |
5 | 0 | 1 | 3,1 | 1,1 | 8,9 |
5 | 0 | 2 | 4,3 | 1,5 | 11 |
5 | 1 | 0 | 3,3 | 1,1 | 9,3 |
5 | 1 | 1 | 4,6 | 1,6 | 12 |
5 | 1 | 2 | 6,3 | 2,1 | 15 |
5 | 2 | 0 | 4,9 | 1,7 | 13 |
5 | 2 | 1 | 7 | 2,3 | 17 |
5 | 2 | 2 | 9,4 | 2,8 | 22 |
5 | 3 | 0 | 7,9 | 2,5 | 19 |
5 | 3 | 1 | 11 | 3,1 | 25 |
5 | 3 | 2 | 14 | 3,7 | 34 |
5 | 3 | 3 | 18 | 4,4 | 50 |
5 | 4 | 0 | 13 | 3,5 | 30 |
5 | 4 | 1 | 17 | 4,3 | 49 |
5 | 4 | 2 | 22 | 5,7 | 70 |
5 | 4 | 3 | 28 | 9 | 85 |
5 | 4 | 4 | 35 | 12 | 100 |
5 | 5 | 0 | 24 | 6,8 | 75 |
5 | 5 | 1 | 35 | 12 | 100 |
5 | 5 | 2 | 54 | 18 | 140 |
5 | 5 | 3 | 92 | 30 | 320 |
5 | 5 | 4 | 160 | 64 | 580 |
5 | 5 | 5 | > 180 | — | — |
Гост 29184-91 продукты пищевые. методы выявления и определения количества бактерий семейства enterobacteriaceae от 23 декабря 1991 —
ГОСТ 29184-91
Группа Н09
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
MКC 07.100.30
ОКСТУ 9109
Дата введения 1993-01-01
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Всесоюзным научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП), ТК 93 «Продукты переработки плодов и овощей»
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Комитета стандартизации и метрологии СССР от 23.12.91 N 2049
3. Настоящий стандарт соответствует ИСО 7402-1985 «Микробиология. Общее руководство для определения Enterobacteriaceae пo методу НВЧ подсчетом колоний» в части порядка проведения исследований
4. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
5. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
6. ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2022 г.
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта бактерий семейства Enterobacteriaceae и два метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и метод посева на поверхность селективно-диагностической среды.
Методы выявления и определения наиболее вероятного числа основаны на высеве продукта и (или) его разведений в жидкую селективную среду, инкубировании посевов при температуре (37±1) °С в течение 24-48 ч, пересеве выделенной культуры на поверхность селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам роста принадлежности выделенных колоний к бактериям семейства Enterobacteriaceae.
Метод определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae посевом на поверхность агаризованной среды основан на высеве 0,1 или 0,2 см продукта или его разведений на поверхность селективно-диагностической среды, инкубировании посевов при (37±1) °С в течение 24 ч, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к бактериям семейства Enterobacteriaceae.
Требования настоящего стандарта являются обязательными.
Отбор проб и подготовка их к испытанию — по ГОСТ 26668 и ГОСТ 26669.
Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:
весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104* с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и пределом допускаемой погрешности ±2 мг (для взвешивания реактивов);
________________
* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008 (здесь и далее).
весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и пределом допускаемой погрешности ±10 мг (для взвешивания продукта);
микроскоп световой биологический, обеспечивающий увеличение в 900-1000;
поплавки (трубки Дархема);
стекла предметные по ГОСТ 9284;
стекла покровные по ГОСТ 6672;
термостат с диапазоном рабочих температур 28-55 °С, позволяющий поддерживать заданную температуру с погрешностью ±1 °С;
бриллиантовый зеленый;
генцианвиолет;
диметил—фенилендиамин;
желчь говяжья сухая или натуральная;
метиловый фиолетовый;
N,N,N’,N’-тетраметил-пара-фенилендиамина дигидрохлорид;
индикаторные бумажки на оксидазу, выпускаются Дагестанским НПО «Питательные среды» и Горьковским НИИ эпидемиологии и микробиологии.
3.1. Приготовление растворов
3.1.1. Щелочной раствор бромкрезолового пурпурного концентрацией 10 г/дм: 1 г бромкрезолового пурпурного переносят в фарфоровую ступку с 19 см раствора гидроокиси натрия концентрацией 0,1 моль/дм и после растворения добавляют 80 см дистиллированной воды. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.
3.1.2. Раствор бриллиантового зеленого концентрацией 5 г/дм: 0,5 г бриллиантового зеленого переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.
3.1.3. Раствор генцианвиолета или кристаллического фиолетового, или метилового фиолетового концентрацией 10 г/дм: 1 г одной из анилиновых красок переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят дистиллированной водой до метки.
3.1.4. Растворы и реактивы для окраски по Граму по ГОСТ 10444.1.
3.1.5. Растворы для определения оксидазы готовят непосредственно перед применением.
3.1.5.1. Раствор N,N,N’,N’-тетраметил-пара-фенилендиамина дигидрохлорида концентрацией 10 г/дм: 1 г реактива переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в дистиллированной воде температурой 10-15 °С.
3.1.5.2. 30-40 мг -нафтола растворяют в 2,5 см ректификованного этилового спирта, добавляют 7,5 см дистиллированной воды и 40-60 мг диметил-n-фенилендиамина.
3.2. Приготовление питательных сред
3.2.1. Среда Кесслера: 10,0 г пептона, 2,5 г глюкозы, 5,0 г сухой говяжьей желчи или 50 см натуральной желчи, 2,0 см раствора генцианвиолета или кристаллического фиолетового, или метилового фиолетового, приготовленных по п.3.1.3, добавляют к 1000 см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45-55 °С, устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (7,3±0,2), разливают по 10 см в пробирки с поплавками и стерилизуют 20 мин при температуре (114±1) °С.
3.2.2. Буферный глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью: 10,0 г пептона, 5,0 г глюкозы, 6,45 г двузамещенного фосфорнокислого безводного натрия, 2,0 г однозамещенного фосфорнокислого безводного калия, 20,0 г сухой говяжьей желчи или 200 см натуральной желчи, 3,0 см раствора бриллиантового зеленого, приготовленного по п.3.1.2, добавляют к 1000 см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45-55 °С и устанавливают рН таким образом, чтобы он составлял при 25 °С (7,2±0,1), после чего среду доводят до кипения.
Среда не подлежит стерилизации в автоклаве, ее разливают по 10 см в стерильные пробирки с поплавками.
3.2.3. Бульон Мак-Конки: 20,0 г пептона, 10,0 г глюкозы, 5,0 г хлористого натрия, 5,0 г сухой говяжьей желчи или 50 см натуральной желчи, 1,0 см раствора бромкрезолпурпура, приготовленного по п.3.1.1, добавляют к 1000 см дистиллированной воды, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45-55 °С и устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (7,2±0,1), разливают по 10 см в пробирки с поплавками и стерилизуют 15 мин при температуре (121±1) °С.
3.2.4. Среда Кода выпускается Дагестанским НПО «Питательные среды», готовится по прописи, указанной на этикетке, но при приготовлении на 1 дм среды добавляют 10,0 г глюкозы.
3.2.5. Среды двойной концентрации готовят по пп.3.2.1-3.2.4, но при приготовлении берут удвоенную массу (объем) ингредиентов, кроме дистиллированной воды, и разливают в посуду с учетом последующего количества добавляемого продукта.
3.2.6. Среда Эндо выпускается Дагестанским НПО «Питательные среды» и готовится по прописи, указанной на этикетке.
3.2.7. Среду Гисса готовят по ГОСТ 10444.1 или используют среду, выпускаемую Дагестанским НПО «Питательные среды», и при этом она готовится по прописи, указанной на этикетке.
3.2.8. Мясо-пептонный агар по ГОСТ 10444.1.
3.2.9. Среда, приготовленная из сухого питательного агара, выпускаемого Дагестанским НПО «Питательные среды».
4.1. Определение количества бактерий семейства Enterobacteriaceae
4.1.1. Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить в 1 г (см) предполагаемое количество бактерий семейства Enterobacteriaceae или их количество, указанное в нормативно-технической документации на конкретный продукт.
4.1.2. При определении количества бактерий семейства Enterobacteriaceae по методу НВЧ высевают три последовательные навески продукта и (или) его разведения, отличающиеся по количеству высеваемого продукта в 10 раз. Каждую навеску продукта и (или) его разведение в трехкратной повторности высевают в колбы или пробирки с одной из питательных сред по пп.3.2.1-3.2.4.
Соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведением и питательной средой 1:9.
4.1.3. При определении количества бактерий семейства Enterobacteriaceae посевом на агаризованную среду по 0,1 или 0,2 см навески продукта или его разведения наносят на поверхность двух параллельных чашек Петри с агаризованной средой по п.3.2.6. Подготовку чашек Петри со средой к посеву и посев проводят по ГОСТ 26670.
При определении количества бактерий семейства Enterobacteriaceae методом мембранных фильтров по ГОСТ 26670 фильтры переносят на поверхность среды Эндо, избегая образования пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.
4.2. Определение присутствия (отсутствия) бактерий семейства Enterobacteriaceae
При определении присутствия (отсутствия) бактерий семейства Enterobacteriaceae в определенной навеске продукта или его эквивалентном разведении эту навеску или разведение вносят в одну из питательных сред по пп.3.2.1-3.2.4.
Метод наиболее вероятных чисел (нвч)
Метод НВЧ используют при испытании ЛС с низким уровнем микробной контаминации, а также в тех случаях, когда нельзя применить другие методы. Метод НВЧ менее чувствителен и точен по сравнению с чашечным агаровым методом или методом мембранной фильтрации, и его используют только для определения общего числа бактерий, так как результаты, полученные при определении общего числа грибов, особенно плесневых, считают недостоверными.
5.3.1. Выполнение испытания
Исследуемый образец готовят в виде раствора, суспензии или эмульсии в разведениях 1:10, 1:100, 1:1000, используя подходящий растворитель. Жидкую питательную среду разливают в 12 стерильных пробирок по 9 мл в каждой. Пробирки ставят в штатив в 4 ряда по 3 пробирки в ряду.
В первый ряд пробирок вносят по 1 мл испытуемого образца в разведении 1:10, во второй ряд – по 1 мл в разведении 1:100, в третий ряд – по 1 мл в разведении 1:1000. В пробирки четвертого ряда вносят по 1 мл разбавителя, который используют для растворения, суспендирования или эмульгирования образца. Посевы инкубируют в стандартных условиях в течение не более 3 сут.
5.3.2. Учет и интерпретация результатов
Отмечают число пробирок в первом, втором и третьем рядах, в которых визуально наблюдают рост микроорганизмов. Среда в пробирках четвертого ряда (контроль разбавителя) должна оставаться стерильной. Полученное трехзначное число соответствует наиболее вероятному количеству жизнеспособных микроорганизмов в 1,0 г или в 1,0 мл лекарственного средства (табл. 5).
Таблица 5 – Наиболее вероятное число микроорганизмов
| Количество пробирок в каждом ряду, в которых наблюдают рост | НВЧ микроорганизмов в 1 г (мл) препарата | ||
| Количество препарата в пробирке, г (мл) | |||
| 0,1 | 0,01 | 0,001 | |
| менее 3 | |||
| 6,1 | |||
| 6,2 | |||
| 9,4 | |||
| 3,6 | |||
| 7,2 | |||
| 7,4 | |||
| 9,2 | |||
| более 1100 |
Пример. В первом ряду рост микроорганизмов наблюдается в 3 пробирках, во втором ряду — в 2 пробирках, в третьем ряду — в 1 пробирке. Полученное число «321» по табл. 5 соответствует цифре «150».
Следовательно, наиболее вероятное число бактерий в 1 г или 1 мл исследуемого образца — 150. Если учет результатов не может быть определен точно в связи с природой исследуемого препарата (помутнение среды, изменение ее цвета и т.п.), делают пересев на соответствующую жидкую или агаризованную среду, чтобы убедиться в наличии роста микроорганизмов.
Определение отдельных видов микроорганизмов
Испытание включает использование селективных и диагностических питательных сред.
§
6.1.1 Испытание на отсутствие энтеробактерий, устойчивых к желчи (качественный метод)
Для восстановления жизнеспособности микроорганизмов используют предварительную инкубацию образца в жидкой питательной среде. С этой целью 10,0 г или 10,0 мл исследуемого образца переносят в 100 мл соево-казеинового бульона (или среды № 8), перемешивают и инкубируют при температуре (22,5 ± 2,5) оС в течение 2 ч, но не более 5 ч. После инкубации снова перемешивают содержимое флакона, в котором проводилось восстановление жизнеспособности микроорганизмов (гомогенат А), и переносят 10 мл (количество, соответствующее 1 г или 1 мл образца) в 100 мл среды обогащения (бульон Мосселя). Посевы инкубируют в течение 24 – 48 ч в стандартных условиях. При появлении роста делают пересев бактериологической петлей на агар Мосселя или среду № 4, которую инкубируют в течение 18 – 24 ч.
Если на агаре Мосселя выявлены типичные колонии энтеробактерий (табл.7), по морфологическим и тинкториальным свойствам представляющие собой грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие цитохромоксидазой (п.8.1), считают, что исследуемый образец контаминирован энтеробактериями, устойчивыми к желчи.
6.1.2. Количественное определение энтеробактерий, устойчивых к желчи
Для посева используют 3 пробирки с 9 мл бульона Мосселя в каждой. Гомогенат А в количестве 1 мл (соответствует 0,1 г или 0,1 мл образца) вносят в первую пробирку, тщательно перемешивают и переносят 1 мл (соответствует 0,01 г или 0,01 мл образца) во вторую пробирку, снова перемешивают и переносят 1 мл (соответствует 0,001 г или 0,001 мл образца) в третью пробирку, меняя пипетку после каждого шага. Посевы инкубируют в течение 24 – 48 ч.
Для подтверждения отсутствия энтеробактерий, устойчивых к желчи, делают пересев бактериологической петлей из каждой пробирки с видимым ростом на агар Мосселя (среда № 4) и инкубируют чашки Петри в течение 18 – 24 ч. Проводят микроскопическое исследование обнаруженных на плотной среде колоний. Выявление грамотрицательных палочковидных неспорообразующих бактерий свидетельствует о присутствии в ЛС энтеробактерий, устойчивых к желчи. Наиболее вероятное количество устойчивых к желчи энтеробактерий в 1 г или 1 мл образца определяют по табл. 6.
Таблица 6 – Интерпретация результатов
| Количество испытуемого образца | НВЧ бактерий в 1 г (мл) образца | ||
| 0,1 г(мл) | 0,01 г(мл) | 0,001 г(мл) | |
| 1 мл гомогената А | 1 мл гомогената А в разведении 1:10 | 1 мл гомогената А в разведении 1:100 | |
| более 103 | |||
| — | от 102 до 103 | ||
| — | — | от 101 до 102 | |
| — | — | — | менее 101 |
Обозначения: – наличие роста; – отсутствие роста
§
6.2.1. Испытание на отсутствие бактерий E. coli (качественный метод)
10 г исследуемого образца, растворенного или разбавленного стерильным фосфатно-буферным раствором 1:10, переносят в количестве 10 мл (соответствует 1 г или 1 мл испытуемого ЛС) в 100 мл соево-казеинового бульона (или среды № 8). Перемешивают и инкубируют в течение 18 – 24 ч. При наличии роста 1 мл содержимого флакона переносят в 100 мл бульона Мак-Конки (или среды № 3) и инкубируют 24 – 48 ч при температуре (43 ± 1) оС.
При обнаружении роста в бульоне бактериологической петлей делают пересев на агар Мак-Конки или среду № 4. Посевы инкубируют в течение 18 – 48 ч (агар Мак-Конки) или 18 – 24 ч (среда № 4). Если после инкубации на плотных питательных средах выявлены колонии, типичные для E. coli (табл. 7), их микроскопируют. При обнаружении в мазках мелких грамотрицательных палочек отдельные типичные колонии пересевают в пробирки на скошенный соево-казеиновый агар или среду № 1 и инкубируют в течение 18 – 24 ч для накопления чистой культуры микроорганизма.
Для идентификации выделенных бактерий используют биохимические тесты на цитохромоксидазу (п.8.1), индол (п.8.2) и способность утилизировать натрия цитрат. Для этого из пробирок с чистой культурой делают пересевы на агар Симмонса (или среду № 14) и соево-казеиновый бульон (или среду № 15). Через 18 – 24 ч инкубации отмечают рост бактерий или его отсутствие на агаре Симмонса (или среде № 14). Утилизацию цитрата устанавливают по смещению рН среды в щелочную сторону (изменению цвета среды с зеленого на синий). Наличие индола определяют по появлению красного кольца на поверхности соево-казеинового бульона (или среды № 15) при добавлении реактива Ковача.
Если в ходе исследования обнаруживают типичные грамотрицательные палочки, не содержащие фермент цитохромоксидазу, не утилизирующие натрия цитрат и образующие индол, считают, что ЛС контаминировано бактериями E. coli.
6.2.2. Количественное определение бактерий E. coli
Количественное определение E.coli проводят так же, как и количественное определение энтеробактерий, устойчивых к желчи (п. 6.1.2), делая пересев из гомогената А в пробирки с бульоном Мак-Конки (или средой № 3). При обнаружении роста в пробирках (табл. 7) из каждой пробирки делают пересев бактериологической петлей на агар Мак-Конки или среду № 4. Посевы инкубируют в стандартных условиях в течение 18 – 48 ч (агар Мак-Конки) или 18 – 24 ч (среда № 4).
При обнаружении на указанных средах типичных колоний бактерий (табл. 7), по морфологическим и тинкториальным свойствам представляющих собой грамотрицательные палочки, которые не содержат фермент цитохромоксидазу, не утилизируют натрия цитрат и образуют индол, делают вывод, что ЛС контаминировано бактериями E. coli. Наиболее вероятное количество клеток E. coli в 1 г или в 1 мл испытуемого образца определяют по табл. 6.
§
Характерные культуральные, морфологические и тинкториальные свойства некоторых микроорганизмов — возможных контаминантов ЛС представлены в табл. 7.
Таблица 7 – Культуральные, морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов-контаминантов
| Питательные среды | Морфология колоний | Окраска по Граму | |
| Escherichia coli | |||
| Бульон Мак-Конки | Обесцвечивание среды, помутнение, газообразование | грамотрицательные палочки, не имеющие спор | |
| Среда № 3 | Изменение окраски среды, газообразование | ||
| Агар Мак-Конки | Кирпично-красные колонии, могут быть окружены зонами выпавшей в осадок желчи | ||
| Среда № 4 | Малиновые или розовые колонии с металлическим блеском, окруженные зонами малинового цвета | ||
| Агар Мосселя | Красные колонии, окруженные красными зонами преципитации | ||
| Salmonella spp. | |||
| Бульон Раппопорта – Вассилиадиса | Помутнение среды при сохранении цвета или отсутствие видимого роста | грамотрицательные палочки, не имеющие спор | |
| Ксилоза-лизин-дезоксихолат агар | Красные колонии с черным центром или без него | ||
| Висмут-сульфит агар (или среда № 5) | Черные колонии с антрацитовым блеском, среда под колониями окрашена в черный цвет | ||
| Агар Мосселя | Красные колонии, окруженные красными зонами преципитации | ||
| Pseudomonas aeruginosa | |||
| Соево-казеиновый бульон (среда № 8) | Помутнение, поверхностный рост в виде пленки | грамотрицательные палочки, не имеющие спор | |
| Цетримидный агар | Зеленоватые колонии, зеленые в УФ свете | ||
| Среда № 16 (ЦПХ-агар) | Зеленоватые колонии, зеленые в УФ свете | ||
| Агар для выявления пиоцианина, среда № 9 | Сине-зеленые колонии, сине-зеленые в УФ свете | ||
| Staphylococcus aureus | |||
| Соево-казеиновый бульон (среда №8) | Равномерное помутнение | грамположительные кокки в виде гроздей | |
| Маннитно-солевой агар (или среда № 10) | Золотисто-желтые колонии, окруженные желтыми зонами | ||
| Staphylococcus epidermidis | |||
| Маннитно-солевой агар (или среда № 10) | Белые колонии, отсутствие желтых зон вокруг колоний | грамположительные кокки в виде гроздей | |
| Candida albicans | |||
| Бульон Сабуро | Придонный рост | грамположительные дрожжеподобные почкующиеся овальные или круглые клетки размером 4–8 мкм | |
| Сабуро агар (среда № 2) | Белые, круглые, выпуклые, гладкие и блестящие колонии | ||
Повторение испытания
В случае необходимости при выявлении контаминации ЛС повторяют тот раздел испытания, результаты которого не соответствуют требованиям нормативной документации. Анализ проводят на удвоенном количестве образцов препарата.
Биохимические тесты для идентификации микроорганизмов
§
Для испытания качества ЛС на микробиологическую чистоту используют питательные среды отечественного или зарубежного производства.
При приготовлении питательных сред в лаборатории необходимо строго придерживаться приведенной рецептуры, а при использовании коммерческих сухих питательных сред — инструкции предприятия-изготовителя. Входящие в состав питательных сред индикаторы и красители добавляют в виде растворов определенной концентрации. Необходимое значение рН питательной среды устанавливают при температуре (22,5 ± 2,5) оС.
Если нет других указаний в нормативной документации, среды стерилизуют в автоклаве при температуре 121 оС в течение 15 мин, при условии валидации процесса стерилизации.
Фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном (рН 7,0):
| · Калия фосфат однозамещенный | 3,6 г |
| · Натрия фосфат двузамещенный | 7,2 г |
| · Натрия хлорид | 4,3 г |
| · Пептон (мясной или казеиновый) | 1,0 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
Нейтрализующая жидкость
| · Твин-80 | 30,0 г |
| · Лецитин (яичный или соевый) | 3,0 г |
| 1,0 г | |
| 1,0 г |
| 4,3 г | |
| 3,6 г |
| 7,2 г |
| 1000,0 мл | |
| рН после стерилизации | 7,6 ± 0,2 |
Полужидкий агар для хранения тест-микроорганизмов
| · Панкреатический гидролизат казеина | 8,0 г | |
| · Натрия хлорид | 5,0 г | |
| · Агар микробиологический | 5,0 г | |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл | |
| рН после стерилизации | 7,0 ± 0,2 | |
Соево-казеиновый агар (Casein Soya Bean Digest agar)
| · Панкреатический гидролизат казеина | 15,0 г |
| · Папаиновый гидролизат бобов сои | 5,0 г |
| · Натрия хлорид | 5,0 г |
| · Агар микробиологический | 15,0 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,3 ± 0,2 |
Альтернативная среда отечественного производства для выращивания аэробных бактерий – среда № 1 для контроля микробной загрязненности, сухая; мясопептонный агар (МПА); агаризованные питательные среды на основе гидролизата рыбной муки (ГРМ).
Бульон Сабуро (Sabouraud Broth)
| · Пептон (мясной) | 5,0 г |
| · Пептон (казеиновый) | 5,0 г |
| · Глюкозы моногидрат | 20,0 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 5,6 ± 0,2 |
Агар Сабуро с глюкозой (Sabouraud 4% Glucose Agar )
| · Пептон (мясной или казеиновый) | 10,0 г |
| · Глюкозы моногидрат | 40,0 г |
| · Агар бактериологический | 15,0 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 5,6 ± 0,2 |
Альтернативная отечественная среда для выращивания дрожжевых и плесневых грибов – среда № 2 (агар Сабуро с глюкозой) для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Для повышения селективности среды с целью предотвращения роста бактерий перед стерилизацией добавляют 50 мг хлорамфеникола (левомицетина) на 1 л среды или перед розливом в чашки Петри в расплавленную среду вносят 0,1 г натриевой соли бензилпенициллина и 0,1 г тетрациклина на 1 л среды в виде стерильных растворов.
Бульон Мосселя для обогащения энтеробактерий (Enterobacteria Enrichment Broth – Mossel)
| · Панкреатический гидролизат желатина | 10,0 г | ||
| · Глюкозы моногидрат | 5,0 г | ||
| · Бычья желчь сухая | 20,0 г | ||
| · Калия фосфат однозамещенный | 2,0 г | ||
| · Натрия фосфат двузамещенный | 8,0 г | ||
| · Бриллиантовый зеленый | 0,015 г | ||
| · Вода очищенная | 1000,0 мл | ||
| рН | 7,2 ± 0,2 | ||
Среду нагревают при температуре 100 °С в течение 30 мин с последующим быстрым охлаждением.
Альтернативная отечественная среда для выращивания аэробных бактерий – среда № 3 для контроля микробной загрязненности, сухая; различных производителей.
Агар Мосселя (Crystal violet, Neutral Red, Bile Agar with Glucose)
| · Дрожжевой экстракт | 3,0 г |
| · Панкреатический гидролизат казеина | 7,0 г |
| · Соли желчи | 1,5 г |
| · Лактозы моногидрат | 10,0 г |
| · Натрия хлорида | 5,0 г |
| · Глюкозы моногидрат | 10,0 г |
| · Агар микробиологический | 15,0 г |
| · Нейтральный красный | 0,03 г |
| · Кристаллический фиолетовый | 0,002 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН | 7,4 ± 0,2 |
Нагревают до кипения. Среду не автоклавируют.
Альтернативная отечественная среда для выделения энтеробактерий – среда № 4 (Эндо) для контроля микробной загрязненности, сухая; различных производителей.
Бульон Мак-Конки (MacConkey Broth)
| · Панкреатический гидролизат желатина | 20,0 г | ||
| · Лактозы моногидрат | 10,0 г | ||
| · Бычья желчь сухая | 5,0 г | ||
| · Бромкрезоловый пурпурный | 0,01 г | ||
| · Вода очищенная | 1000,0 мл | ||
| рН после стерилизации | 7,3 ±0,2 | ||
Альтернативная отечественная среда обогащения для энтеробактерий – среда № 3 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Агар Мак-Конки (MacConkey Agar)
| · Панкреатический гидролизат желатина | 17,0 г | ||
| · Пептон (мясный или казеиновый) | 3,0 г | ||
| · Лактозы моногидрат | 10,0 г | ||
| · Натрия хлорид | 5,0 г | ||
| · Соли желчи | 1,5 г | ||
| · Агар микробиологический | 13,5 г | ||
| · Нейтральный красный | 0,03 г | ||
| · Кристаллический фиолетовый | 0,001 г | ||
| · Вода очищенная | 1000,0 мл | ||
| рН после стерилизации | 7,1 ± 0,2 | ||
Перед стерилизацией кипятят 1 мин, постоянно встряхивая.
Альтернативная отечественная среда для выделения энтеробактерий – среда № 4 (Эндо) для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Накопительная среда для бактерий рода Salmonella (бульон Раппопорта – Вассилиадиса)
| · Соевый пептон | 4,5 г |
| · Магния хлорид шестиводный | 29,0 г |
| · Натрия хлорид | 7,2 г |
| · Калий фосфорнокислый двузамещенный | 0,18 г |
| · Калий фосфорнокислый однозамещенный | 1,26 г |
| · Малахитовый зеленый | 0,036 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 5,2 ± 0,2 |
Среду автоклавируют в течение 15 мин при температуре 115 оС.
Ксилоза, лизин, дезоксихолат агар (Xylose, Lisine, Deoxycholate Agar)
| · Ксилоза | 3,5 г |
| · L–лизин | 5,0 г |
| · Лактозы моногидрат | 7,5 г |
| · Сахароза | 7,5 г |
| · Натрия хлорид | 5,0 г |
| · Дрожжевой экстракт | 3,0 г |
| · Феноловый красный | 0,08 г |
| · Агар микробиологический | 13,5 г |
| · Натрия дезоксихолат | 2,5 г |
| · Натрия тиосульфат | 6,8 г |
| · Железа аммоний цитрат | 0,8 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН | 7,4 ± 0,2 |
Доводят до кипения, охлаждают до температуры 50 °С и разливают в чашки Петри. Среду не автоклавируют.
Висмут-сульфитный агар (Bismuth Sulfite agar)
| · Мясной экстракт | 5,0 г |
| · Мясной пептон | 10,0 г |
| · Глюкозы моногидрат | 5,0 г |
| · Натрия фосфат двузамещенный | 4,0 г |
| · Железа сульфат | 0,3 г |
| · Бриллиантовый зеленый | 0,025 г |
| · Висмута сульфит | 8,0 г |
| · Агар микробиологический | 15,0 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН | 7,6 ± 0,2 |
Среду не автоклавируют. Приготовленная среда непрозрачна, зеленого цвета.
Альтернативная отечественная среда для выделения сальмонелл – среда № 5 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Соево-казеиновый бульон (Casein Soya Bean Digest Broth)
| · Панкреатический гидролизат казеина | 17,0 г | ||
| · Папаиновый гидролизат бобов сои | 3,0 г | ||
| · Натрия хлорид | 5,0 г | ||
| · Калия фосфат двузамещенный | 2,5 г | ||
| · Глюкозы моногидрат | 2,5 г | ||
| · Вода очищенная | 1000,0 мл | ||
| рН после стерилизации | 7,3 ± 0,2 | ||
Альтернативная отечественная среда для выращивания бактерий – среда № 8 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Цетримидный агар (Cetrimide Agar)
| · Панкреатический гидролизат желатина | 20,0 г | ||
| · Магния хлорид | 1,4 г | ||
| · Калия сульфат двузамещенный | 10,0 г | ||
| · Цетримид (цетилпиридиния бромид) | 0,3 г | ||
| · Агар микробиологический | 13,6 г | ||
| · Глицерин | 10,0 мл | ||
| · Вода очищенная | 1000,0 мл | ||
| рН после стерилизации | 7,2 ± 0,2 | ||
Альтернативная отечественная среда для выделения синегнойной палочки – ЦПХ (среда № 16) – агар для выделения синегнойной палочки, сухая.
ЦПХ агар (среда № 16)
| · Пептон сухой ферментативный | 20,0 г | ||
| · Калий сернокислый | 7,6 г | ||
| · Магний сернокислый семиводный | 2,4 г | ||
| · Сода кальцинированная | 1,0 г | ||
| · Фенозан-кислота | 0,2 г | ||
| · ЦПХ (N-цетилпиридиний хлористый 1-водный) | 0,3 г | ||
| · Агар микробиологический | 8,0 г | ||
| · Вода очищенная | 1000,0 мл | ||
| рН | 7,2 ± 0,2 | ||
Среду не автоклавируют.
Агар для выявления пиоцианина Pseudomonas (Pseudomonas Agar Medium for Detection of Pyocyanin)
| · Панкреатический гидролизат желатина | 20,0 г | ||
| · Магния хлорид безводный | 1,4 г | ||
| · Калия сульфат безводный | 10,0 г | ||
| · Агар микробиологический | 15,0 г | ||
| · Глицерин | 10,0 мл | ||
| · Вода очищенная | 1000,0 мл | ||
| рН после стерилизации | 7,2 ± 0,2 | ||
Все компоненты, кроме глицерина, растворяют в воде. Нагревают при перемешивании и кипятят 1 мин. Добавляют глицерин и стерилизуют.
Альтернативная отечественная среда для идентификации синегнойной палочки – среда № 9 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Маннитно-солевой агар
| · Пептон ферментативный сухой | 10,0 г |
| · D-Маннит | 10,0 г |
| · Натрия хлорид | 75,0 г |
| · Агар микробиологический | 15,0 г |
| · Феноловый красный | 0,025 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,4 ± 0,2 |
Альтернативная отечественная среда для выделения и идентификации золотистого стафилококка – среда № 10 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Трехсахарный агар с солями железа (Triple Sugar–Iron–Agar)
| · Мясной экстракт | 3,0 г |
| · Дрожжевой экстракт | 3,0 г |
| · Пептон (казеиновый или мясной) | 20,0 г |
| · Натрия хлорид | 5,0 г |
| · Лактозы моногидрат | 10,0 г |
| · Сахароза | 10,0 г |
| · Глюкозы моногидрат | 1,0 г |
| · Железо–аммоний цитрат | 0,3 г |
| · Натрия тиосульфат | 0,3 г |
| · Феноловый красный | 0,025 г |
| · Агар микробиологический | 12,0 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,4 ± 0,2 |
Среду разливают в пробирки, заполняя их на 1/3 объема. После стерилизации среду оставляют для застывания таким образом, чтобы образовались столбик и скошенная часть над ним.
Альтернативная отечественная среда для идентификации сальмонелл – среда № 13 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Цитратный агар Симмонса
| · Натрия хлорид | 5,0 г |
| · Магния сульфат · Аммония дигидрофосфат · Калия гидрофосфат · Натрия цитрат · Бромтимоловый синий · Агар микробиологический · Вода очищенная | 0,2 г 1,0 г 1,0 г 3,0 г 0,08 г 20,0 г 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,2 ± 0,2 |
Альтернативная отечественная среда для идентификации E. coli – среда № 14 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Питательный агар с глюкозой
| · Триптический гидролизат казеина с содержанием аминного азота 150 мг % · Экстракт кормовых дрожжей · Агар микробиологический · Глюкоза · Натрия хлорид · Вода очищенная | 150 мл 5,0 г 20,0 г 5,0 г 5,0 г до 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,2 ± 0,2 |
Стерилизация: при температуре 121 °С, 15 мин
Мясопептонный агар (МПА) с 0,5 % глюкозы
| · Мясная вода · Натрия хлорид · Пептон ферментативный сухой · Агар микробиологический · Глюкоза | 1000,0 мл 5,0 г 10,0 г 20,0 г 5,0 г |
| рН после стерилизации | 7,4 ± 0,1 |
Стерилизация: при температуре 121 °С, 15 мин.
Питательный агар с 9 % натрия хлорида (солевой агар)
| · Мясная вода · Натрия хлорид · Пептон ферментативный сухой · Агар микробиологический · Глюкоза | 1000,0 мл 5,0 г 10,0 г 20,0 г 5,0 г |
| рН после стерилизации | 7,4 ± 0,1 |
Питательный агар с 9 % натрия хлорида может быть приготовлен на основе МПА с добавлением 9 % натрия хлорида.
Мясотрипсиновый гидролизат с содержанием аминного азота (0,60 0,05) %
| · Мясо (говядина) · Вода питьевая · Железа поджелудочная крупного рогатого скота · Хлороформ · Натрий углекислый кислый | 1000,0 г 2000,0 мл 130,0 г 1000,0 мл 13,0 г |
| рН после стерилизации | 7,4 ± 0,1 |
Стерилизация: при температуре 121 °С 15 мин.
Кровяной агар с добавлением дефибринированной крови
| · 2 % мясопептонный агар · Дефибринированная кровь | 950,0 мл 50,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,4 ± 0,1 |
В расплавленный и охлажденный до температуры 45 °С МПА добавляют дефибринированную кровь (человека, барана, кролика), перемешивают до однородного состояния и разливают по чашкам Петри.
Приготовление дефибринированной крови. Кровь асептически собирают в стерильный сосуд, на дне которого находятся стеклянные бусы, закрывают пробкой и встряхивают 20 – 25 мин до выпадения фибрина; жидкую, не свернувшуюся часть крови, добавляют в нужном количестве к охлажденному до температуры (45 2) оС МПА.
Среда с мочевиной
| · Гидролизат казеина, сброженный E. coli М-17 (содержание аминного азота (6,6 ± 0,6 г/ла) ) · Натрия хлорид · Агар микробиологический · Мочевина · Лактоза · Глюкоза · Индикатор комбинированный (Андреде с добавлением 0,35 % бромтимолового синего)б) · Вода очищенная | 80,0 мл 5,0 г 10,0 г 10,0 г 10,0 г 1,0 г 40,0 мл до 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,1 ± 0,1 |
Стерилизация: при температуре 110 оС 15 мин.
а)Приготовление сброженного казеинового гидролизата. Микробную суспензию готовят суспендированием в 0,9 % растворе натрия хлорида 24-часовой культуры E. coli М-17, выращенной на МПА. Полученную микробную суспензию доводят до 10 МЕ мутности по СО. На 1 л казеинового гидролизата добавляют 3 – 5 мл микробной суспензии, инкубируют в течение 24 ч при температуре (37 1) оС и стерилизуют.
б)Приготовление комбинированного индикатора Андреде. К 400 мл воды дистиллированной прибавляют 1 г фуксина кислого и 64 мл 1 М раствора натрия гидроксида, выдерживают 1 сут при температуре (37 1) оС и 2 сут при комнатной температуре. Хранят в бутыли темного стекла с притертой пробкой при комнатной температуре в защищенном от света месте.
При приготовлении комбинированного индикатора Андреде к 100 мл индикатора Андреде добавляют 350 мг бромтимолового синего.
Среда с мочевиной по Преусу
| · Мясотрипсиновый гидролизат с содержанием аминного азота (0,60 ± 0,05) % а) · Агар микробиологический · Глюкоза · Мочевина (раствор 50 %-ный водный) · Бромтимоловый синий | 1000,0 мл 15,0 г 5,0 г 20,0 мл 12,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,0 ± 0,1 |
Среда Гаузе № 2 агаризованная
| · Бульон Хоттингера с содержанием амминного азота 700 мг% · Пептон сухой · Натрия хлорид · Глюкоза · Агар микробиологический · Вода очищенная | 30,0 мл 5,0 г 5,0 г 10,0 г 30,0 г до 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,2 ± 0,2 |
Бульон Хоттингера
| · Гидролизат Хоттингера · Натрия хлорид · Вода очищенная | 24,0 г 5,0 г до 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,2 ± 0,2 |
Желточно-солевой агар
| · Мясопептонный агар · Натрия хлорид · Желточная взвесь (1 желток на 200 мл 0,9 % раствора натрия хлорида) · Вода очищенная | 850,0 мл 90,0 г 150,0 мл до 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,2 ± 0,2 |
Возможно внесение изменений в составы питательных сред и замена материалов животного происхождения компонентами промышленного производства при условии подтверждения качества и валидации их применения для проведения испытаний по показателю «Микробиологическая чистота».
§
10.1.1. Приготовление рабочей взвеси тест-микроорганизмов
Культуры бактерий и грибов C. albicans смывают с поверхности скошенного агара стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида. Готовят стандартные взвеси каждого тест-штамма, соответствующие 10 МЕ по стандартному образцу мутности. Для культур B. subtilis, B. cereus и C. albicans — это концентрация 107 КОЕ/мл, для E. coli, S. abony, P. aeruginosa, S. aureus — 109 КОЕ/мл. Стандартизованные взвеси методом последующих десятикратных разведений доводят стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида до концентрации 103 КОЕ/мл. Для определения фактической концентрации рабочих взвесей бактерий и C. albicans культуры высевают поверхностным методом из концентрации 103 КОЕ/мл по 0,1 мл на чашку Петри с соответствующей аттестованной агаризованной средой.
Для смыва конидий A. brasiliensis с агара Сабуро с глюкозой используют стерильный 0,9 % раствор натрия хлорида, содержащий 0,05 % твина-80. Количество конидий в 1 мл взвеси определяют с помощью камеры Горяева или посевом подходящего разведения на аттестованный агар Сабуро с глюкозой или среду № 2.
Для посева готовят рабочую взвесь A. brasiliensis с концентрацией конидий около 0,5 
103 в 1 мл, которую высевают поверхностным методом по 0,1 мл на чашки с агаром Сабуро с глюкозой (или средой № 2).
Приготовленные рабочие взвеси тест-микроорганизмов используют для определения ростовых свойств питательных сред. Количество клеток тест-штаммов для внесения в жидкую или агаризованную питательные среды не должно превышать 102 КОЕ.
10.1.2. Испытание агаризованных сред
Испытуемую и аттестованную агаризованные среды разливают в чашки Петри диаметром 90 мм по 15 – 20 мл, подсушивая агар после застывания. По 0,1 мл рабочей взвеси тест-микроорганизма с концентрацией 103 КОЕ/мл засевают поверхностным методом на чашки Петри с испытуемой и аттестованной средами в двойной повторности.
На агаризованнных средах после инкубации подсчитывают колонии тест-штаммов микроорганизмов и определяют коэффициент прорастания Кпр по формуле:
,
где: N – средняя арифметическая числа колоний на чашке Петри с испытуемой средой;
Nо – средняя арифметическая числа колоний на чашке Петри с аттестованной средой.
10.1.3. Испытание жидких сред
Жидкие испытуемые и аттестованные питательные среды разливают в стерильные пробирки размером 15 × 150 мм по 10 мл. По 0,1 мл рабочей взвеси тест-штамма микроорганизма с концентрацией 103 КОЕ/мл засевают в пробирки с испытуемой и стандартной средой (по 3 пробирки для каждого вида среды). Инкубируют при соответствующей температуре в течение минимального для этого теста времени. Рост микроорганизмов определяют визуально.
10.1.4. Требование к ростовым свойствам питательных сред
Испытуемая агаризованная среда считается годной к использованию, если коэффициент прорастания не менее 0,7 по сравнению с аттестованной питательной средой.
Испытуемая жидкая среда считается годной к использованию, если на испытуемой и аттестованных средах наблюдают визуально одинаковый рост тест-штамма.
§
10.2.1. Проведение испытания
Для определения селективных свойств питательных сред испытуемую и аттестованную среды контаминируют штаммами-ассоциантами, каждым в отдельности, с посевной дозой на 2 порядка выше, чем доза тест-штамма.
Посев на агаризованные среды проводят поверхностным методом. В 2 чашки с каждой средой (испытуемой и стандартной) вносят по 0,1 мл рабочей взвеси штамма-ассоцианта с концентрацией 105 КОЕ/мл.
Для посева на жидкие питательные среды в 2 пробирки с каждой средой вносят по 0,1 мл рабочей взвеси с концентрацией 105 КОЕ/мл штамма-ассоцианта. На всех засеянных питательных средах (в чашках Петри и пробирках) после наиболее длительного срока инкубации для этого теста при соответствующей температуре отмечают отсутствие роста штамма-ассоцианта.
10.2.2.Требование к селективным свойствам питательных сред
Испытуемая селективная среда считается годной к использованию, если при посеве штаммов-ассоциантов наблюдается полное отсутствие их роста.
Определение диагностических свойств питательных сред
10.3.1. Выполнение испытания
Испытание диагностических свойств проводят для таких питательных сред, как агар Мосселя (или среда № 4), агар Мак-Конки, ксилозо-лизин-дезоксихолат-агар (или среда № 5), цетримидный агар (или ЦПХ-агар), агар для выявления пиоцианина (или среда № 9), маннитно-солевой агар (или среда № 10), трехсахарный агар с солями железа (или среда № 13), цитратный агар Симмонса (или среда № 14).
Для подтверждения диагностических свойств питательной среды бактериологической петлей делают посев бульонной культуры тест-микроорганизмов (каждого в отдельности) на 2 чашки Петри или в 2 пробирки с испытуемой средой. После инкубации в стандартных условиях определяют характерные признаки тест-штаммов определенного вида микроорганизмов: внешний вид колоний, цвет, наличие пигмента, ореол вокруг колоний, изменение цвета среды и др. (табл. 7).
Для подтверждения селективных свойств диагностических питательных сред делают посев бульонной культуры штаммов-ассоциантов (каждого в отдельности) на испытуемую среду. После инкубации в стандартных условиях рост штаммов-ассоциантов должен отсутствовать.
10.3.2. Требование к диагностическим свойствам питательных сред
Испытуемая среда считается годной к использованию, если морфологические и диагностические признаки тест-микроорганизмов соответствуют описанию, приведенному в табл. 8, при этом рост штаммов-ассоциантов полностью отсутствует.
§
Сухие питательные среды необходимо хранить герметично упакованными, в темном сухом месте при температуре 2 – 30 оС. После вскрытия упаковки на флаконе необходимо написать дату и далее хранить при комнатной температуре до окончания срока годности. Приготовленные из сухих смесей и разлитые во флаконы питательные среды хранят 1 мес при комнатной температуре или 3 мес при температуре 2 – 8 оС. Срок годности сред, разлитых в чашки Петри, составляет 7 сут при температуре 2 – 8 оС. Исключение составляет среда № 4, разлитая в чашки Петри, срок годности которой не более 3 сут при хранении без доступа света.
Таблица 8 – Тест-микроорганизмы и условия инкубации для определения ростовых и селективных свойств питательных сред
| Питательные среды | Применение | Тест–штаммы микроорганизмов | Условия инкубации |
| · Соево-казеиновый агар · Среда № 1 для выращивания бактерий | Выделение аэробных микроорганизмов | Bacillus subtilis ATCC 6633 или Bacillus cereus ATCC 10702; Escherichia coli ATCC 8739 или АТСС 25922; Staphylococcus аureus ATCC 6538 | 72 ч (32,5 ± 2,5) оС |
| · Бульон Сабуро | Выделение дрожжевых грибов | Candida albicahs РКПГY/NCTC 885-653 или АТСС 10231 | 5 сут (22,5 ± 2,5) оС |
| · Агар Сабуро с глюкозой · Среда № 2 для выращивания грибов | Выделение дрожжевых и плесневых грибов | Candida albicahs РКПГY/NCTC 885-653 или АТСС 10231; Aspergillus brasiliensis АТСС 9642,АТСС 16404 ВКМF1119 или A. niger РКПГF106 | 5 сут (22,5 ± 2,5) оС |
| · Бульон Мосселя · Бульон Мак-Конки · Среда № 3 | Обогащение энтеробактерий | Escherichia coli ATCC 8739 или АТСС 25922; Salmonella enterica subsp. enterica serovar abony IHE 103/39 или NCTC 6017 Штаммы-ассоцианты:Staphylococcus аureus ATCC 6538 | 24– 48 ч (32,5 ± 2,5) оС |
| · Агар Мак-Конки · Агар Мосселя · Среда № 4 для выделения энтеробактерий | Выделение энтеробактерий | Escherichia coli ATCC 8739 или АТСС 25922; Salmonella enterica subsp.enterica serovar abony IHE 103/39 или NCTC 6017 Штаммы-ассоцианты для определения селективных свойств:Staphylococcus аureus ATCC 6538 | 24 – 48 ч (32,5 ± 2,5) оС |
| · Ксилоза-лизин-дезоксихолат агар · Висмут-сульфитный агар · Среда № 5 для идентификации бактерий рода Salmonella | Выделение бактерий рода Salmonella | Salmonella enterica ssp. enterica serovar abony IHE 103/39 или NCTC 6017 Штаммы-ассоцианты для определения селективных свойств: Escherichia coli ATCC 8739 или АТСС 25922; Staphylococcus аureus ATCC 6538 или Bacillus cereus ATCC 10702 | 24 – 48 ч (32,5 ± 2,5) оС |
| · Cоево-казеиновый бульон · Среда № 8 для выращивания бактерий | Накопление аэробных бактерий | Bacillus cereus ATCC 10702 или Bacillus subtilis ATCC 6633; Escherichia coli ATCC 8739 или АТСС 25922; Staphylococcus аureus ATCC 6538; Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 | 24 ч (32,5 ± 2,5) оС |
| · Агар для выявления пиоцианина P. aeruginosa · Среда № 9 для идентификации P. aeruginosa | Выделение P. aeruginosa | Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 | 24 – 48 ч (32,5 ± 2,5) оС |
| · Цетримидный агар · ЦПХ-агар для выделения P. aeruginosa | Идентификация P. aeruginosa | Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Штаммы-ассоцианты для определения селективных свойств:Escherichia coli ATCC 8739 или АТСС 25922; Staphylococcus аureus ATCC 6538 | 24 – 48 ч (32,5 ± 2,5) оС |
| · Маннитно-солевой агар · Среда № 10 для идентификации S. aureus | Идентификация S. aureus | Staphylococcus аureus ATCC 6538; Staphylococcus еpidermidis АТСС 14990 или АТСС 1228 Штамм-ассоциант для определения селективных свойств:Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 | 48 ч (32,5 ± 2,5) оС |
| · Бульон Раппопорта – Вассилиадиса | Обогащение бактерий рода Salmonella | Salmonella enterica subsp. enterica serovar abony IHE 103/39 или NCTC 6017 | 24 ч (42,5 ± 2,5) оС |
| · Трехсахарный агар с солями железа · Среда № 13 для идентификации бактерий рода Salmonella | Идентификация бактерий рода Salmonella | Salmonella enterica subsp. enterica serovar abony IHE 103/39 или NCTC 6017; Escherichia coli ATCC 8739 или АТСС 25922 | 24 ч (32,5 ± 2,5) оС |
| · Цитратный агар Симмонса · Среда № 14 для идентификации E. coli | Идентификация E. coli | Escherichia coli ATCC 8739 или АТСС 25922; Salmonella enterica subsp. enterica serovar abony IHE 103/39 или NCTC 6017 | 24 ч (32,5 ± 2,5) оС |
§
11.2.1. Метод прямого посева
Из полученной суспензии испытуемого образца соответствующего разведения по 1 мл высевают на чашки Петри или в широкие (d = 20 мм, h = 200 мм) пробирки (флаконы) со скошенными столбиками питательной среды.
На чашках Петри суспензию распределяют по всей поверхности питательной среды без применения шпателя (осторожными вращательными движениями). Чашки выдерживают 30 – 40 мин на плоскости стола, не переворачивая, до полного впитывания суспензии в агар, после чего переворачивают вверх дном и инкубируют в термостате.
На средах, скошенных в пробирках (флаконах), посев распределяют путем обкатки и инкубируют в термостате сначала в горизонтальном положении – 2 сут, а в оставшийся период – в вертикальном.
Посев суспензии в пробирки со скошенным агаром с мочевиной делают пастеровской пипеткой уколом до дна пробирки, а остатки посевного материала при выведении пипетки растирают по поверхности скошенной части столбика среды и инкубируют в термостате.
Посев образцов препаратов, в которых не допускается присутствие посторонних микроорганизмов и грибов или допускается не более 50 КОЕ/единицу препарата, производят из исходного разведения испытуемого образца. Посев образцов препаратов, в которых допускается общее количество аэробных микроорганизмов 102 КОЕ/единицу препарата, осуществляют из разведения 1:10 (10-1) испытуемого образца.
Препараты, в состав которых входят живые колибактерии: на чашки Петри с агаром Эндо высевают по 0,5 мл суспензии исходного разведения испытуемого образца. Материал распределяют по поверхности среды шпателем Дригальского, затем тем же шпателем производят посев на новую чашку Петри с агаром Эндо для получения изолированных колоний.
При испытании препаратов, в которых не допускается контаминация, перед посевом на среды из каждого образца делают мазки, которые затем, в зависимости от присутствующих в них пробиотических бактерий, окрашивают по Граму или по Цилю-Нильсену, и микроскопируют. Мазок исследуют в 10 полях зрения. В микропрепарате должны присутствовать только характерные для исследуемого образца пробиотика бактерии.
11.2.2. Метод определения степени контаминации аэробными микроорганизмами
Для определения степени контаминации аэробными бактериями готовят дополнительное разведение, для чего 1 мл микробной суспензии из исходного разведения или из разведения 1 : 10 (в зависимости от лекарственной формы и предельно допустимых значений норм микробной контаминации) переносят в пробирки с 9 мл 0,9 % раствора натрия хлорида и перемешивают 8 – 10 раз, получая следующее разведение, т.е. 10-1 или 10-2 соответственно. Затем производят посев на чашки Петри по 1 мл из разведения 10-1 и 10-2 (или из исходного разведения и 10-1) на 2 чашки для каждого разведения.
Посев образцов препаратов, в которых допускается общее количество аэробных микроорганизмов 102 КОЕ в единице препарата, проводят из разведения 10-1 и 10-2. Посев образцов препаратов, в которых допускается общее количество аэробных микроорганизмов не более 50 КОЕ/единицу препарата, проводят из исходного разведения и 10-1.
11.2.3. Метод посева штрихом
Чашку Петри с агаризованной питательной средой делят на 4 – 5 секторов. Посев из исходного разведения испытуемого образца начинают в первом секторе, тщательно втирая взвесь петлей в агар. Затем этой же петлей продолжают посевы во втором и последующих секторах. В последних секторах должны расти изолированные колонии.
11.2.4. Метод определения наличия фага в колисодержащих препаратах
По 1,0 мл исходного разведения испытуемого образца высевают на чашки Петри с МПА. Посевной материал распределяют по всей поверхности среды, покачивая чашку Петри, чтобы получить сплошной газон. Остатки суспензии удаляют стерильной пастеровской пипеткой. Закрытые чашки с посевами выдерживают на столе, не переворачивая, 30 – 40 мин (до полного впитывания суспензии в агар), после чего их переворачивают вверх дном и инкубируют в термостате при температуре (20 ± 2) оС в течение (19 ± 1) ч.
По окончании инкубации чашки просматривают на наличие зон фаголизиса. Если на фоне роста E. coli на поверхности чашки Петри обнаруживаются зоны фаголизиса любого размера и формы, производят повторный посев на удвоенном количестве образцов.
§
Через 72 ч после начала инкубирования посевов и окончательно через 5 – 8 сут подсчитывают число колоний бактерий (допустимой аэробной микрофлоры) на 2 чашках (каждого разведения), находят среднее значение (для колоний, выросших на 2 чашках одного разведения) и, умножая его на показатель разведения, вычисляют число бактерий в 1 таблетке (капсуле, суппозитории и др.) или в 1 г.
Если при посеве образца из разведений 10-1 и 10-2 нет роста, результат отмечают следующим образом: «В 1 капсуле (таблетке, суппозитории и.д.) менее 10 КОЕ бактерий».
При обнаружении в посевах роста условно-патогенных бактерий (энтеробактерий, протеев, гемолизирующих бактерий и др.) и грибов, считают, что качество препарата не соответствует требованиям по показателю «Микробиологическая чистота».
Если количество аэробных микроорганизмов превышает допустимый предел количества КОЕ в 1 таблетке (капсуле, суппозитории и т.д.), то контроль повторяют на удвоенном количестве образцов.
Таблица 9 – Условия проведения испытания на микробиологическую чистоту препаратов пробиотиков, в которых не допускаются микроорганизмы-контаминанты(суспензии и лиофилизаты дляприготовления растворов или суспензий для приема внутрь и местного применения)
| Группировочное название | Питательные среды | Чашки, пробирки | Условия инкубирования | Учитываемые микроорганизмы | Учет результатов |
| Бифидосодержащие препараты | МПА или ГРМ-агар | Пробирки (или чашки Петри) | (37 ± 1) оС 8 сут | Аэробные микроорганизмы | Не должно быть роста |
| Питательный агар с глюкозой или МПА с 0,5 % глюкозы | Пробирки (или чашки Петри) | (37 ± 1) оС 8 сут | Аэробные микроорганизмы | ||
| Агар Сабуро | Пробирки (или чашки Петри) | (22 ± 2) оС 8 сут | Дрожжевые и плесневые грибы | ||
| Лактосодержащие препараты (лактобактерии — микроаэрофилы) | МПА | Чашки Петри (или пробирки) | (37 ± 1) оС 8 сут | Аэробные микроорганизмы | Не должно быть роста |
| Агар Сабуро | Пробирки (или чашки Петри) | (22 ± 2) оС 8 сут | Дрожжевые и плесневые грибы | ||
| Лактосодержащие препараты (лактобактерии — факультативные анаэробы) | Питательный агар с 9 % натрия хлорида | Пробирки (или чашки Петри) | (37 ± 1) оС 8 сут | Аэробные микроорганизмы | Не должно быть роста |
| Агар Сабуро с антибиотиками | Пробирки (или чашки Петри) | (22 ± 2) оС 8 сут | Дрожжевые и плесневые грибы | ||
| Агар Эндо | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 24 – 48 ч | Представители семейства Enterobacteriaceae | ||
| МПА | Пробирки (или чашки Петри) | (37 ± 1) оС 8 сут | Аэробные микроорганизмы | Не должно быть роста бактерий-контаминантов (допускается рост лактобактерий в виде мелких сероватых полупрозрачных колоний, образующих сплошной газон) | |
| Колисодержащие препараты | Питательный агар с 9 % натрия хлорида | Пробирки (или чашки Петри) | (37 ± 1) оС 8 сут | Аэробные микроорганизмов | Не должно быть роста |
| Агар Сабуро с антибиотиками | Пробирки (или чашки Петри) | (22 ± 2) оС 8 сут | Дрожжевые и плесневые грибы | ||
| Агар Эндо | Чашки Петри | (37 ± 1) оС (19 ± 1) ч | Лактозонегативные представители семейства Enterobacteriaceae | Не должно быть роста лактозонегативных колоний | |
| МПА (контроль на отсутствие фаголизиса) | Чашки Петри | (20 ± 2) оС (19 ± 1) ч | Для контроля контаминации фагом | Не должно быть зон фаголизиса (для препаратов с содержанием E. coli не менее 1010 допускается не более 10 БОЕ бактериофага) | |
| Препараты, содержащие бактерии рода Bacillus(споровые пробиотики) | Агар Сабуро | Чашки Петри | (22 ± 2) оС 8 сут | Дрожжевые и плесневые грибы | Не должно быть роста бактерий-контаминантов(возможен рост бактерий рода Bacillus – гладкие белые или с желтовато-розовым оттенком колонии) |
| Агар Эндо | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 24 — 48 ч | Представители семейства Enterobacteriaceae | Не должно быть роста бактерий-контаминантов(возможен рост бактерий рода Bacillus — мелкие бесцветные или с оттенком от слабо-розового до красноватого колонии) | |
| Среда Гаузе № 2 | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 8 сут | Аэробные микроорганизмы | Не должно быть роста бактерий-контаминантов (возможен рост бактерий рода Bacillus — шероховатые с фестончатыми краями розовато-бежевые и гладкие белые колонии) | |
| Кровяной агар | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 24 – 48 ч | Аэробные микроорганизмы | Не должно быть роста бактерий-контаминантов (возможен рост бактерий рода Bacillus — шероховатые с фестончатыми краями серовато-розовые и гладкие бежево-коричневые колонии, без гемолиза) | |
| Среда с мочевиной и индикатором Андреде или по Преусу | Пробирки | (37 ± 1) оС 72 ч | Бактерии рода Proteus | Не допускается изменение цвета среды (возможен рост бактерий рода Bacillus – мелкие бесцветные колонии, возможно покраснение среды) | |
| Желточно-солевой агар (или среда № 10) | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 72 ч | Стафилококки | Не должно быть роста бактерий-контаминантов (возможен рост бактерий рода Bacillus – круглые белые, хорошо снимающиеся колонии) |
Примечание. При появлении сомнительных колоний производят микроскопическое исследование.
Таблица 10 – Условия проведения испытания на микробиологическую чистоту препаратов пробиотиков, в которых допускается содержание посторонних микроорганизмов и грибов (суппозитории, таблетки, капсулы)
| Группировочное название/ лекарственная форма | Питательные среды | Чашки, пробирки | Условия инкубирования | Учитываемые микроорганизмы | Учет результатов |
| Бифидосодержащиепрепараты | МПА | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 8 сут | Аэробные бактерии | Подсчитывают число бактериальных колоний допустимых бактерий-контаминантов |
| Среда Эндо | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 24 – 48 ч | Бактерии семейства Enterobacteriaceae | Не должно быть роста | |
| Кровяной агар | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 24 – 48 ч | Гемолизирующие микроорганизмы | Не должно быть колоний, окруженных зоной гемолиза | |
| Среда с мочевиной и индикатором Андреде или по Преусу | Пробирки | (37 ± 1) оС 24 – 48 ч | Бактерии рода Proteus | Не допускается изменение цвета среды | |
| Агар Сабуро | Чашки Петри | (22 ± 2) оС 8 сут | Дрожжевые и плесневые грибы | Не должно быть роста | |
| Среда № 9 | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 24 – 48 ч | Pseudomonas aeruginosa | ||
| Среда № 10 | чашки Петри | (37 ± 1) оС 24 – 48 ч | Staphylococcus aureus | ||
| Лактосодержащие препараты (лактобактерии — микроаэрофилы) | МПА или среда № 1 | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 8 сут | Аэробные микроорганизмы | Подсчитывают число бактериальных колоний допустимых бактерий-контаминантов |
| Среда Эндо | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 24 – 48 ч | Бактерии семейства Enterobacteriaceae | Не должно быть роста | |
| Кровяной агар | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 24 – 48 ч | Гемолизирующие микроорганизмы | Не должно быть колоний, окруженных зоной гемолиза | |
| Среда с мочевиной и индикатором Андреде или по Преусу | Пробирки | (37 ± 1) оС 24 – 48 ч | Бактерии рода Proteus | Не допускается изменение цвета среды | |
| Агар Сабуро или среда № 2 | Чашки Петри | (22 ± 2) оС 8 сут | Дрожжевые и плесневые грибы | Не должно быть роста | |
| Среда № 9 | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 24 – 48 ч | Pseudomonas aeruginosa | ||
| Среда № 10 | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 24 – 48 ч | Staphylococcus aureus | ||
| Лактосодержащие препараты (лактобактерии – факультативные анаэробы) | Питательный агар с 9 % натрия хлорида | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 8 сут | Аэробные микроорганизмы | Подсчитывают число бактериальных колоний допустимых бактерий-контаминантов |
| Среда Эндо | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 24 – 48 ч | Бактерии семейства Enterobacteriaceae | Не должно быть роста | |
| Кровяной агар | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 24 – 48 ч | Гемолизирующие микроорганизмы | Не должно быть колоний, окруженных зоной гемолиза | |
| Среда с мочевиной и индикатором Андреде или по Преусу | Пробирки | (37 ± 1) оС 24 – 48 ч | Бактерии рода Proteus | Не допускается изменение цвета среды | |
| Агар Сабуро с антибиотиками | Чашки Петри | (37 ± 1) оС 8 сут | Дрожжевые и плесневые грибы | Не должно быть роста |
§
Общее число аэробных микроорганизмов (бактерий и грибов) не более 10 КОЕ в 100 мл. Не допускается наличие Еscherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa в 100 мл.
Для анализа микробиологической чистоты воды для инъекций отбирают образец в объеме не менее 1000,0 мл.
Исследование проводят методом мембранной фильтрации в асептических условиях. Для посева используют мембранные фильтры из нитроцеллюлозы с диаметром пор не более 0,45 мкм и внешним диаметром 47 мм. Для смачивания фильтра применяют стерильный 0,9 % раствор натрия хлорида (не менее 5 мл).
Для определения общего числа аэробных микроорганизмов фильтруют 100 мл воды для инъекций в двойной повторности. После окончания фильтрации каждый фильтр переносят в чашки Петри на поверхность агаризованной среды R2A следующего состава:
| · Гидролизат казеина | 0,5 г |
| · Дрожжевой экстракт | 0,5 г |
| · Протеозный пептон | 0,5 г |
| · Глюкоза | 0,5 г |
| · Крахмал растворимый | 0,5 г |
| · Калия гидрофосфат | 0,3 г |
| · Магния сульфат | 0,024 г |
| · Натрия пируват | 0,3 г |
| · Агар микробиологический | 15,0 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,2 ± 0,2 |
Посевы инкубируют в термостате при температуре (32,5 ± 2,5) оС в течение 5 сут. Производят подсчет колоний через 48 – 72 ч (предварительные результаты), через 5 сут (окончательные результаты) и определяют среднее арифметическое число аэробных микроорганизмов (бактерий и грибов суммарно) в 100 мл воды.
Для определения общего числа аэробных микроорганизмов допустимо использовать соево-казеиновый агар или среду № 1 для выделения бактерий, агар Сабуро или среду № 2 – для выращивания грибов.
Для определения Еscherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa фильтруют 100 мл воды в двойной повторности. В соответствии с получаемыми результатами для определения каждого микроорганизма допустима фильтрация 200 мл воды очищенной через один фильтр.
После окончания фильтрации 2 фильтра переносят в чашки Петри на поверхность агаризованной среды Эндо (среда № 4). Посевы инкубируют при температуре (32,5 ± 2,5) оС в течение 24 ч. Микроскопируют — малиново-красные колонии с металлическим блеском или без него, окруженные малиновыми зонами преципитации, неслизистые. При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек отдельные колонии отсевают на скошенный в пробирках соево-казеиновый агар (среду № 1) и инкубируют в течение 18 – 24 ч. После инкубации проводят идентификацию в соответствии с п.8*. Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие бактерии в виде палочек, не содержащие фермент цитохромоксидазу, не утилизирующие натрия цитрат и образующие индол, считают, что вода контаминирована E. сoli.
Следующие 2 мембранных фильтра переносят в чашки Петри на поверхность агаризованной среды № 9. Посевы инкубируют при температуре (32,5 ± 2,5) оС в течение 24 – 48 ч. При наличии на фильтрах, помещенных на среду № 9, колоний бактерий, выделяющих в агар сине-зеленый пигмент пиоцианин, проводят микроскопирование и идентификацию в соответствии с п.8*. Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие бактерии в виде палочек, выделяющие сине-зеленый пигмент пиоцианин, обладающие ферментом цитохромоксидазой и растущие при температуре (42 ± 1) оС, считают, что вода контаминирована P. aeruginosa.
Для определения S. аureus 2 мембранных фильтра переносят в чашки Петри на поверхность питательной среды – маннитно-солевой агар или среда № 10 – и инкубируют в течение 24 – 48 ч. Золотисто-желтые колонии, окруженные желтыми зонами, отсевают на соево-казеиновый агар или среду № 1. Проводят микроскопирование и идентификацию в соответствии с п.8*. Если в образце обнаружены грамположительные кокки, расположенные в виде гроздьев, ферментирующие маннит (маннитно-солевой агар, среда № 10), содержащие фермент коагулазу, считают, что образец воды контаминирован S. аureus.
Примечание.
* — Для идентификации могут быть использованы другие методы (тест-системы, автоматические анализаторы и др.).
Вода очищенная
Общее число аэробных микроорганизмов (бактерий и грибов) не более 100 КОЕ в 1 мл. Не допускается наличие Еscherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa в 100 мл.
Для анализа микробиологической чистоты воды очищенной отбирают образец в объеме не менее 1000 мл.
Для определения общего числа аэробных микроорганизмов фильтруют следующие объемы воды очищенной: 1 мл , 10 мл и 100 мл (в двойной повторности). Допускается для проведения испытания использовать один объем воды, выбранный в соответствии с получаемыми результатами. Далее анализ выполняют в соответствии с п.12.1.
§
Для устранения антимикробного действия препарата используют следующее:
А)Увеличивают разведение препарата, взяв больший объем растворителя/разбавителя/питательной среды, но не более 200 мл. Для иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП) допускается только разбавление питательной средой.
Экспериментально установленное соотношение объемов питательной среды и посевного материала, обеспечивающее нейтрализацию антимикробного действия препарата, должно соблюдаться при испытании препарата на стерильность.
Б) Применяют метод мембранной фильтрации с последующим промыванием фильтров, если препарат растворим в водных разбавителях или в изопропилмиристате (ИПМ).
В)Вместо стандартного разбавителя можно использовать стерильную нейтрализующую жидкость, промышленного производства или приготовленную в лаборатории, следующего состава:
· Твина-80 -30,0 г
· Лецитина яичного -3,0 г
· L-гистидина гидрохлорида -1,0 г
· Пептона (мясного или казеинового) -1,0 г
· Натрия хлорида -4,3 г
· Калия фосфата однозамещенного -3,6 г
· Натрия фосфата двузамещенного -7,2 г
· Воды очищенной -1000 мл
рН 7,0±0,2
Г) Используют неспецифические инактиваторы. Для инактивации консервантов, входящих в состав ряда лекарственных препаратов, в разбавитель и/или в питательные среды до стерилизации вносят следующие неспецифические инактиваторы: 3 % твина-80 или 0,3 % лецитина (яичного или соевого) от объема среды. В случае, если в препарате имеется более двух консервантов различной химической структуры, в среду вносят 3 % твина-80, 0,3% лецитина, 0,1% L-гистидина и 0,5 % натрия тиосульфата одновременно. Если разведение в вышеприведенном растворе не инактивирует антимикробные свойства ЛС, увеличивают концентрацию твина-80 или лецитина.
Некоторые инактиваторы антимикробного действия ЛС указаны в табл.4 ОФС «Микробиологическая чистота».
Учитывая, что в состав тиогликолевой среды входит тиогликолят натрия — инактиватор ртутных соединений, перед проведением испытаний ИЛП, содержащих ртутные консерванты, методом прямого посева, проводят определение нейтрализующих свойств этой среды, подтверждающих инактивацию.
Для нейтрализации действия других консервантов, входящих в состав ИЛП, инактиваторы не используются, а основным способом устранения их действия является разведение питательной средой. Посев испытуемого препарата в питательную среду проводят в соотношении 1:20, с учетом результатов определения антимикробного действия препарата.
Д)Применяют специфические инактиваторы, нейтрализующие антимикробное действие ЛС, но не угнетающие рост микроорганизмов.
Для инактивации пенициллинов и цефалоспоринов, независимо от их лекарственной формы, в буферный раствор, используемый для растворения, суспендирования или эмульгирования образца, а также в питательные среды перед их применением, асептически вносят стерильный раствор β-лактамазы в количестве, указанном в фармакопейной статье или нормативной документации.
Ингибирующее действие β-лактамазы на пенициллины и цефалоспорины необходимо определять, внося в среды с ферментом и антибиотиком от 50 до 100 КОЕ S. aureus. Типичный рост тест-штамма в питательной среде служит подтверждением того, что концентрация фермента β-лактамазы достаточна.
Для инактивации сульфаниламидных препаратов, независимо от их лекарственной формы, в буферный раствор, используемый для растворения, суспендирования или эмульгирования образца, а также в питательные среды, если необходимо, до стерилизации вносят парааминобензойную кислоту (ПАБК) из расчета 0,05 — 0,1 г/л среды.
При разработке новых препаратов в фармакопейную статью и нормативную документацию следует включать сведения о наличии/отсутствии антимикробного действия препарата с рекомендациями по его устранению и информацию о методе его испытания на стерильность. В случае изменения технологического процесса или состава препарата необходимо подтвердить отсутствие антимикробного действия.
§
Отбор образов для испытания
При проведении испытания на стерильность число контролируемых первичных упаковок определяется с учетом общего количества единиц в серии. Отбирают образцы препарата, как указано в табл. 1.
Испытание на стерильность в процессе производства ИЛП проводят в соответствии с регламентом производства.
При необходимости, могут быть регламентированы особые требования в отношении необходимого количества контролируемых емкостей, обеспечивающие надежность контроля стерильности препарата.
Для посева на соответствующую питательную среду используют образец в количестве, приведенном в табл. 2.
Таблица 1 — Количество единиц препарата для проведения испытания на стерильность в зависимости от объема серии
| Количество единиц (ампул, флаконов и др.) в серии* | Минимальное количество единиц (ампул, флаконов и др.) для посева на каждую питательную среду** |
| Лекарственные средства | |
| 1.Парентеральные лекарственные средства: | |
| 10 % или 4 | |
| 2 % или 20 | |
| 2 % или 10 |
| |
| 2.Неинъекционные лекарственные средства (в том числе глазные): | |
| 5 % или 2 | |
| См. графу «Парентеральные лекарственные средства» |
| 3.Твердые формы, ангро: | |
| Каждую | |
| 20 % или 4 | |
| 2 % или 10 |
* если количество единиц в серии неизвестно, то используют максимальное количество, указанное в колонке.
** если содержимого одной емкости ЛС (кроме ИЛП) достаточно для инокулирования двух питательных сред, то в этой колонке приводится количество образцов, необходимых для испытания на стерильность на двух питательных средах.
Таблица 2 — Минимальное количество испытуемого препарата для посева на питательные среды
| Количество препарата в первичной упаковке | Минимальное количество препарата для посева на каждую питательную среду |
| Жидкие | |
| · Менее 1 мл | весь объем первичных упаковок, объединенных до 1 мл |
| · 1 – 40 мл | ½ содержимого, но не менее 1 мл |
| · 40 – 100 мл | 20 мл |
| · более 100 мл | 10 % содержимого, но не менее 20 мл |
| · Антибиотики (жидкости) | 1 мл |
| · Другие препараты, растворимые в воде или ИПМ | содержимое упаковки, но не менее 200 мг |
| Нерастворимые препараты, мази и кремы, поддающиеся эмульгированию или суспендированию | содержимое упаковки, но не менее 200 мг |
| Твердые | |
| · Менее 50 мг | все содержимое |
| · 50 — 300 мг | ½ содержимого, но не менее 50 мг |
| · 300 мг – 5 г | 150 мг |
| · более 5 г | 500 мг |
